疟疾疫苗的制作方法
【专利摘记】本发明提供高度变异的PfEMP1形成玫瑰花结的抗原(rosetting?antigen)的抗原戒指的亚类，其具有不错用于产生灵验针对疟原虫、恶性疟原虫(Plasmodium?falciparum)的许多不同株和分离株的免疫应酬的表位。在这方面，本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜卵白-1(PfEMP1)抗原或其一个或多个片断，其用于在东说念主中产生免疫应酬。
【专利说明】疟疾疫苗 发明限制
[0001] 本发明提供不错用于产生（raise)东说念主中免疫应酬的抗原。具体地，本发明提供产 生对多种恶性痕原虫（Plasmodium falciparum)株娇傲交叉反映性的免疫应酬而且不错用 于颐养和/或谢绝疟疾而且尤其是重症疟疾的抗原。
[0002] 发明布景
[0003] 病原体抗原的序列各样性是成立针对许多传染性疾病的侵扰手艺的空匮。由恶 性痕原虫（Plasmodium falciparum)引起的痕疾中，由var基因编码的不同名义抗原的 PfEMPl眷属是在疟疾发病机制和临床疾病中施展舛错作用的粘附分子。PfEMPl是保护性 免疫的主要靶点，然则，由于PfEMPl眷属内鄙俚的序列各样性，成立基于PfEMPl的药物 或疫苗是有可贵的。
[0004] 每种恶性疟原虫分离株具有50-60种不同的PfEMPl变体，而且不同分离株的 PfEMPl组库大部分不访佛[3， 4， 5， 6]。PfEMPl变体以互相摈斥的面孔抒发，而且从一种 var基因到另一种的转录调遣导致恶性疟原虫感染的红细胞的抗原变异[7]。取自鄙俚的 全球寄生虫群体的样品的PfEMPl变体娇傲基本上无戒指的序列各样性[5， 8]，使PfEMPl 成为格外具有挑战性的颐养靶点[9](还参见：Pierce SK，Miller LH.J Immunol2009; 182:5171-7)。
[0005] 如对高度多态的寄生虫抗原预期的，对自然感染后[10， 11]或用重组PfEMPl结构 域免疫后[11，12]出现的活的感染的红细胞上的针对PfEMPl的名义反映性抗体是主要变 体特异的。然则，居住在地点病区域的儿童在人命的前几年发展出防护恫吓人命的疟疾的 抗体[13]，指示跳动株的抗体应酬可能存在，或指示引起重症疟疾的寄生虫是戒指的抗原 类型的[14， 15]。尚未矍铄出寄生虫名义抗原的调换跳动株的抗体的抗原戒指的亚类。
[0006] 除了在免疫和免疫藏匿方面的作用之外，PfEMPl变体是介导与多种东说念主细胞类型 和名义受体的互相作用的粘附卵白[16， 17]。三个主要PfEMPl眷属（A，B和C，基于保守的 上游序列和基因组位置）在其粘附功能方面不同[16]。类型B和C变体（每种单倍体寄生 虫基因组大致40-50种变体）勾搭于内皮卵白而且取销受体⑶36[18， 19]。比较之下，类 型A变体（每种单倍体寄生虫基因组大致10种变体）不勾搭CD36[18， 19]但的确介导形 成玫瑰花结（rosetting) [11，12， 20， 21]，其中感染的红细胞勾搭于未感染的红细胞的粘 附表型[22]。类型A var基因的转录与多种地舆环境[23， 24， 25， 26]和实验室实验[27] 中的重症疟疾关连联，然则B和C var基因的转录在引起无并发症疾病的弱毒感染下发生 [23， 24， 25， 26]。
[0007] 形成玫瑰花结是进犯的寄生虫毒力因子，与非洲儿童中恫吓人命的疟疾 [28， 29， 30， 31，32]和灵长类动物疟疾模子中的高寄生虫负荷[33]关连。形成玫瑰花结 引起对微血管血流的病感性梗阻[34]和裁汰恶性疟原虫形成玫瑰花结赋予针对重症疟 疾的相当进度保护的才气的东说念主红细胞多态性[35， 36]。恶性疟原虫形成玫瑰花结的寄生 虫不错被分为两种不同表型：来自正常东说念主血清的勾搭IgM自然抗体（"非免疫"IgM)的 那些[37， 38]和不勾搭的那些。非免疫IgM勾搭被以为加强玫瑰花结中感染的和未感染 的红细胞间的粘附互相作用[37， 39， 40]并还不错通过遮蔽舛错表位在免疫藏匿中施展 作用[41]。之前对PfEMPl和形成玫瑰花结的研究荟萃于具有非IgM勾搭表型的寄生虫 [11，12， 20， 21，42]。尽管此表型临床上进犯，但是因为来自临床患病儿童的形成玫瑰花结 的寄生虫主要为IgM勾搭型，是以于今忽略了勾搭IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的详实研 究[38]。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明基于高度变异的PfEMPl形成玫瑰花结的抗原的抗原戒指亚类的发现。此 夕卜，发明东说念主已发现尽管有相当进度的序列各样性，但是PfEMPl变体具有不错用于产生有 效针对疟原虫（恶性疟原虫）的许多不同株和分离株的免疫应酬的表位。
[0010] 在第一个方面，本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜卵白-1 (PfEMPl)抗 原或其一个或多个片断，其用于产生东说念主中免疫应酬。
[0011] 在第二个方面，本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜卵白-1 (PfEMPl)抗 原或其一个或多个片断用于制备用于产生东说念主中的免疫应酬的药物的用途。
[0012] 在进一步的方面，本发明提供产生东说念主中的免疫应酬的方法，所述方法包括向东说念主受 试者施用免疫原性量的一种或多种恶性疟原虫红细胞膜卵白-1 (PfEMPl)抗原或其一个或 多个片断的方法。
[0013] 在一个实践决策中，在东说念主受试者中产生的免疫应酬包括系统性抗体应酬，包括一 种或多种抗体同种型。通过例如的面孔，东说念主中产生的免疫应酬不错包括IgM， IgG，IgA， IgD 和/或IgE抗体同种型。
[0014] 成心地，本文形容的免疫应酬是交叉反映性的；也便是说，所述免疫应酬包含不 仅对被本发明使用的特定PfEMPl抗原，而且对其它PfEMPl变体娇傲一定进度的亲和力， 遴荐性和/或特异性的抗体。计划到PfEMPl抗原间的序列并吞性/同源性的类似的穷乏， 从PfEMPl抗原的仅有限遴荐中产生交叉反映性抗体应酬的才气是既成心，也另东说念主骇怪的。
[0015] 本文形容的免疫应酬不错进一步助于缓解，减少和/或扼杀疟疾/重症疟疾的症 状。此外或备选地，东说念主受试者中产生的免疫应酬不错减少寄生虫（疟原虫属）负荷和/或 从宿主中取销或扼杀寄生虫。手艺东说念主员将和洽此种类型的免疫应酬不错被称为"保护性免 疫应酬"。
[0016] 因此，本文形容的抗原，用途和/或方法不错用于产生东说念主宿主中交叉反映性和/ 或保护性抗体，所述抗体对恶性疟原虫的PfEMPl抗原娇傲一定进度的亲和力，遴荐性和 /或特异性。
[0017] 在一个实践决策中，被本发明使用的PfEMPl抗原是IgM形成玫瑰花结的变体。本 限制手艺东说念主员将和洽IgM形成玫瑰花结的PfEMPl变体特征在于其勾搭来自东说念主血清的IgM 抗体的才气。因此，在更进一步的实践决策中，本发明提供PfEMPlIgM形成玫瑰花结的变 体（或其一个或多个片断），其用于提升手免疫应酬；PfEMPlIgM形成玫瑰花结的变体（或 其一个或多个片断）用于制备用于产生东说念主中的免疫应酬的药物的用途；和产生东说念主中的免疫 应酬的方法，所述方法包括向东说念主受试者施用免疫原性量的一种或多种PfEMPlIgM形成玫瑰 花结的变体或其一个或多个片断的方法。
[0018] 在一个实践决策中，本发明的PfEMPl抗原默示特定的PfEMPl变体。在这方面， 发明东说念主发现定名为HB3var6， TM284varl和ITvar60的（IgM形成玫瑰花结的）PfEMPl变体 包含大概调换保护性和/或交叉反映性免疫应酬的表位。
[0019] 因此，本发明的一个实践决策提供一种或多种PfEMPl抗原或其一个或多个片断， 其用于产生东说念主受试者中的免疫应酬，其中所述PfEMPl抗原选开脱以下组成的组：
[0020] (i) HB3var6
[0021] (ii)TM284varl ;和
[0022] (iii) ITvar60。
[0023] 此外，应该和洽本发明中形容的各样药物和方法还不错使用如以上（i)-(iii)列 出的特定PfEMPl变体（或其一个或多个片断）。
[0024] 手艺东说念主员将和洽HB3var6PfEMP1抗原不错获自恶性疟原虫株HB3。类似地， TM284varlPfEMPl抗原和ITvar60PfEMPl抗原不错分别获自恶性疟原虫株TM284和IT/ PAR+。
[0025] 定名为HB3var6的PfEMPl变体具有以下氨基酸序列：
[0026] SEQ ID NO ： 1
[0027] MGNTIPKPPDPIYINESYQSTRNVLERYAESIKQQAAADAEKCEKSLKGDLTKAEFRGAHIETVGVQKY SYSNPCGLNHT
[0028] WNTNLLHDRVKDRDPCHGRNQKRFDEGQVYECGSGIIKGNGNNRNGGSYAPPRRRHICDKNLEALTVQN TKNSNDLLGNI
[0029] LVTAKYEGESIVNSYANSGMFNVCTALARSFADI⑶IVRGKDLYSGNKQEKEKRKQLEKNLQKIFRNIY DKLLEYNKTNG
[0030] EIEARYGSDKENFFQLREDWWKANRDQVWRAITCKAPQDANYFRKIS⑶TKVFTSQGQCGHSETNVPTN LDYVPQFLRWF
[0031] DEWAEEFCRVREHKLKKIKEACRGKNDEKDCSREGYDCNKTNLRLNEIFMDLECPNCEKACTSYKEWIE NKQKEFNKQKK
[0032] KYEKEIENDESNSHSTYDNELYNNLKRNYPSFENFVETLKEGAYCTNGIIEGKIDFNKQYDTFSHSQYC KSCPILGAKCK
[0033] NGQCNSFNDINCTKIPTMTNIRIHSTESPKDIYILVNDKKNREHSLELKDAFNDCDIFKRIRKQKWYCK YKCNLDVCELK
[0034] NFNRDMDDERLISIEVLIKRWLKYFLNDYNQIKENLNQCINNGTNTLCINDCHKNCECIEKWIKEKEKE WKVIKDRYVEQ
[0035] YNNNDKDVSSKLKTFLKQDLFTNYVKNALDPDETLDKMKESSVCNVPNKLNGTSCKKKDVINILLNRLN EKIDPCKNQHK
[0036] ATKGKECCDKLPKIAD⑶TSDDEDDDEEDVSVTSGEKQNVKQDCAGKKSDEVCEMVKKLI⑶NNGMSGR IESCNPKTGTY
[0037] PPWKNHASLVEDNRTWMPPRRQKLCVSALTQEGKIKNKEDIRKHFITCAAIETHFAWHRYKNHNANAES KLKTGKIPDDF
[0038] LRSMKYTFGDYRDIFFGTDISSCDKIKNASNTIKSILENKTKKKKGDKLIEDNEKHKEWWNEHGKEIWE GMLCALEKVGG
[0039] SVNIKSTYNYDTIKNDLEDFASPPQFLRWFTEWSDEFCQERKKLEAKVKEYCKKDYVGCNKQNTKANNS CVSACEAFQHY
[0040] MKSKMSEYDTQKKKFEAEKSGKEPEYEGFSTKDASEYLKEKCLHGTCDCMEKVKNIDDYWKNPHKTYDD NKLETKCECPQ
[0041] TPPKPCEIVKTLLEDNNGRHVDACNLKYEGKKEKHYSWNCNPNKFKNGEEGACIPPRRQKLYIYNLEKF TGGTSEIELRK
[0042] AFIECAAIETFFSWHKFKKDKEREDKEKQDLVGYTSTVDEKHQKDLQSGKIPEEFKRQMFYTFGDYRDI CLGNDMGNDNY
[0043] NKNISTKVRSILNSGETPEEWWQKHGPQIWEGMLCALSYDTEKQKKVQDVHNNLIAPPNNNKYNDVKLV SKSGKLHTSLS
[0044] DFATVPQFLRWFEEWVEEFCRKKKIKIDKIEDECRGEYDNGGKKYCS⑶GYDCDKRYLSHNKMFADLNC LGCEKECRNYK
[0045] KWIEEKVEEFYKQKKKYEKGFENTRTNLDBKYVKEFYETSAGKYKSVDLFLDTLKERSHCSMGMVNRKI DFKNPLETFSP
[0046] SIYCKTCPLYGVNCNSRECVDITENEFKKKNVLDEIIINDKSHTSIDIEMIDRRGQYMQENLDNPLFKE SYLLKSVRDQK
[0047] WDCNFIHNKIDLCEINKFNENIDTDESITFKVLIERWLQDFLEGYYISKKQIDLFTKKEENKCECVKKW AEKKEGEWEKI
[0048] NEHFNKQKHDDAFDMDFKVKNYFEKNASDLKDWIDNFKRLNNIDDYQVCNVHNNCKSADKKNKIDMVSI LLSELKKEIET
[0049] CKNQGNEKTKIKCDASPTNDELDEEYELGTTDTSPSAAPDICKDVIQSKSEETICRDDKRVDCNKVGKD DPIKVPMDPKS
[0050] GEDHLKNMGDKHNCSGIIIKTNGEWKNTKQLNYPNPCESIYASPRRQKFCVHELDKAKNQKELRTKLLT VAANQGYNLAI
[0051] KHHEYKDKYTVNPCNALKYSFYDYQHIILGDDPMEPEKWDTESALKRIFGNRNTEDAKPLSRKRKDFWK ENKECVWSAMK
[0052] CGYNEGIKKGNKSNNIPECKDSIPTQFDGVPQFLMWFTEWSEDFCNHKKTHLKKLEQGCRGCTLRIDGT CEKDGSGCQKC
[0053] SQACEEYKAWLQNWKDQYKKQSKKYS⑶KKKELYKTVPKVKNSTHAYEYLQTQLEKLCEKGKCDYTCMK NPSTENSTENM
[0054] PESLDVKPDIVKDKCPCPPQKIEKPDSTLNCIDRSAFELYAKAKSDLHGVKDKLKGNNTKNIYEETTNG KNDDNIICKIN
[0055] ESISKQNNVCKKNENLFDDIDKWDCKKRTNTVPIENICIPPRRKLMCAYPLKNLGVKKNTSEVLFNKVL RTAAYEGKHIK
[0056] ESWEKAEKSKKKKTQICDAMKYSFADLGDIIRGRDILIFNNGNNEIERDLKAVFQSIYDKWKSDSNNNK DKYPDLTSFRS
[0057] AffffDANRKDIWKAMTCGAPEDATLFKKLEKWGIPNLILSQHKCGHNDDPPIDDYIPQRLRWMKEffGEYV CKILNENVNDM
[0058] KNDCDKCTLNDKKCSDEDDGNKCRSCKEKCKEYTKLIYNLKSQFYILEKHYNELYTKAQNNTTYFTNDN DKKVIEFFKKV
[0059] KKDCDVGTPDKYLDKAIHCIHYDFTKNGTKSKPYVFNNQPEKYKNLCSCTITNHPLDKCPLPDKTDDYC KIIRHINPCIT
[0060] INLDNNLDTWTGFWWHNISHKNKGVLVPPRRRHLCTRELTGIRYRKNDKDNLKQNLIDSAFNQGILLGK TFKDYSDQGLE
[0061] YMKYSFADY⑶IIKAKDMIGGSNIDDFNNDLKKMFPEHHSENMGKTTISREQffffEANKTHVWHAMLCGY HQGIINPNLSR
[0062] RRPKPLEEGTQSSIATKTIPSNWCQLPNDYSTDQFLRWFQEWIENFCTRKKVLEKEAQEQCKNITCNND TGKTNTKCTEA
[0063] CKNYSNFILIKKKEYESLNSQYDMNYKKIVEHKNALEYFKDKCKNNCECLSKHIDNGKNWKEPYETIDD SELIGKCKCKK
[0064] VKPKTPDVIPAGATETKEKDTPHAPEKPQQPPQPLPPSDEPFDPTILQTYIPFGIALALGSIAFLFMKK KPKSPVDLLRV
[0065] LNIPKRDYEMPTLKSKNRYIPYASDRYKGKTYIYME⑶SS⑶EKYAFMSDTTDVTSSESEYEELDINDI YVPGSPKYKTL
[0066] IEVVLEPSKSNGNTLGDDMVPTTNTFTDEEWNELKHDFISQYVQREPLDVPQYDESTQLPMNIVGNVLD DGMDEKPFITS
[0067] IHDRDLYTGEEISYNINMSTNSMDDPKYVSNNVYSGIDLINDTJS⑶RIDIYDELLKRKENELFGTNHV KQTSIHSVAKL
[0068] TNSDPIHNQLDLFHTWLDRHRDMCNTWNTKEELLDKLNEQWNKDNDG⑶IPNDNKKLNTDVSFEIDMDL· TKGKKEFSNMD
[0069] TILDDMEDDIYYDVNDENPSVDNIPMDHNKVDVPKKVHVEMKILNNTSNGSLEQEFPISDVWNI
[0070] 此外，HB3var6PfEMPl变体由以下核酸序列编码：
[0071] SEQ ID NO ：2
[0072] ATGGGGAATACAATACCAAAGCCTCCGGATCCAATTTATATAAATGAAAGTTATCAAAGTACCAGAAAT GTTTTGGAACG
[0073] TTATGCCGAAAGTATAAAGCAACAGGCAGCTGCTGATGCAGAAAAATGTGAGAAATCGTTGAAAGGAGA TTTGACAAAAG
[0074] CAGAATTTCGTGGTGCTCATATAGAGACAGTTGGTGTCCAGAAATATAGTTATTCTAATCCATGTGGTT TGAATCATACA
[0075] TGGAATACTAATTTATTGCATGATAGAGTGAAGGATAGAGATCCGTGCCATGGTAGAAATCAAAAACGT TTTGATGAAGG
[0076] TCAAGTATATGAATGTGGTAGTGGTATAATCAAAGGTAATGGAAATAACAGAAATGGGGGATCCTATGC GCCACCCAGAA
[0077] GAAGACATATATGTGATAAAAACTTGGAAGCTCTAACTGTGCAAAATACAAAAAATTCTAACGACTTGT TAGGAAATATC
[0078] TTGGTCACAGCAAAATATGAAGGCGAATCTATTGTGAATAGTTATGCAAATAGCGGAATGTTCAATGTA TGTACTGCACT
[0079] TGCACGAAGTTTTGCAGATATAGGTGATATCGTACGCGGCAAAGATCTATATAGTGGTAATAAACAAGA AAAAGAAAAAA
[0080] GAAAACAATTAGAGAAGAATTTACAAAAAATTTTTAGGAATATATATGACAAATTATTAGAGTATAACA AGACGAATGGG
[0081] GAGATAGAAGCTCGCTACGGAAGTGATAAAGAAAATTTTTTTCAATTAAGAGAAGATTGGTGGAAAGCG AACAGAGATCA
[0082] AGTATGGAGAGCTATAACATGTAAAGCTCCACAAGACGCTAATTATTTTAGAAAAATTTCAGGAGATAC TAAGGTGTTTA
[0083] CAAGTCAAGGACAATGTGGGCATAGTGAAACAAACGTTCCTACGAATCTAGATTATGTCCCTCAATTTT TACGATGGTTT
[0084] GATGAATGGGCAGAAGAGTTTTGCAGAGTAAGAGAACATAAGTTGAAAAAGATTAAAGAAGCGTGTCGT GGGAAAAATGA
[0085] TGAAAAAGATTGTAGTCGTGAGGGTTACGATTGTAATAAAACAAATCTAAGACTTAATGAAATTTTTAT GGATTTAGAAT
[0086] GTCCAAATTGTGAAAAAGCGTGTACAAGTTATAAGGAATGGATAGAAAATAAACAAAAGGAATTTAATA AACAAAAGAAA
[0087] AAATACGAAAAGGAAATAGAAAATGATGAAAGTAATTCTCATAGTACATATGATAACGAATTATATAAT AATCTGAAAAG
[0088] AAATTATCCTTCCTTTGAAAATTTTGTAGAAACATTAAAAGAAGGAGCGTATTGTACTAATGGCATTAT AGAAGGTAAAA
[0089] TAGATTTTAATAAACAATATGACACTTTTTCCCATTCACAGTACTGTAAATCATGTCCTATATTAGGTG CCMATGCAAG
[0090] AATGGACAATGCAATTCATTTAATGATATAAATTGTACAAAAATACCGACTATGACTAATATAAGAATT CACAGCACTGA
[0091] AAGTCCTAAGGATATTTATATTCTGGTGAATGATAAAAAAAATAGAGAACATTCTCTTGAATTAAAGGA TGCTTTTAATG
[0092] ATTGTGATATTTTTAAAAGAATAAGAAAACAAAAATGGTATTGTAAATATAAATGTAACTTAGATGTAT GTGAACTAAAA
[0093] AATTTTAATAGGGATATGGATGATGAAAGATTAATTTCAATCGAAGTATTGATTAAACGTTGGTTAAAG TATTTTTTAAA
[0094] TGATTATAATCAAATAAAAGAAAATTTAAATCAATGTATAAATAATGGAACAAATACATTATGTATAAA CGATTGTCATA
[0095] AAAATTGTGAATGCATAGAGAAATGGATAAAAGAAAAAGAGAAAGAGTGGAAAGTTATAAAAGATCGTT ATGTAGAACAA
[0096] TATAATAATAACGATAAAGACGTTTCTTCTAAACTTAAAACTTTTTTGAAACAGGATTTGTTTACTAAC TATGTTAAAAA
[0097] TGCCTTGGACCCCGATGAAACGTTAGATAAGATGAAAGAATCTAGTGTATGCAATGTACCTAATAAACT CAATGGAACAT
[0098] CATGTAAAAAAAAGGACGTGATAAATATTTTACTTAATAGACTTAATGAAAAAATAGATCCTTGCAAAA ATCAACATAAA
[0099] GCAACCAAAGGTAAAGAATGTTGTGATAAATTACCTAAAATTGCAGATGGTGATACATCAGACGATGAA GATGACGATGA
[0100] AGAGGATGTTTCTGTGACTTCTGGAGAAAAACAAAATGTAAAACAAGATTGTGCTGGTAAGAAATCGGA TGAGGTGTGCG
[0101] AAATGGTGAAGAAACTTATTGGAGATAACAATGGAATGAGTGGTCGAATAGAGAGTTGTAATCCAAAAA CTGGAACTTAT
[0102] CCTCCATGGAAAAACCACGCAAGTTTAGTGGAAGACAACAGAACGTGGATGCCTCCAAGAAGACAGAAA TTATGCGTAAG
[0103] TGCTTTAACACAAGAAGGTAAAATAAAAAATAAAGAAGATATAAGAAAACATTTTATTACATGTGCGGC TATAGAAACAC
[0104] ATTTTGCGTGGCATAGATATAAAAACCATMTGCGAATGCTGAAAGCAAATTAAAAACTGGAAAAATTC CTGATGATTTT
[0105] TTAAGATCCATGAAATATACTTTTGGTGATTATAGAGATATATTTTTTGGAACAGATATTTCATCATGT GATAAAATTAA
[0106] AAATGCCTCAAATACTATAAAATCTATATTAGAAAATAAAACAAAGAAGAAAAAAGGAGATAAACTCAT TGAAGATAATG
[0107] AAAAACACAAAGAGTGGTGGAATGAACATGGGAAGGAGATATGGGAAGGAATGTTATGTGCACTAGAAA AAGTTGGAGGA
[0108] AGCGTCAATATCAAATCCACGTACAACTACGATACTATAAAAAATGATCTAGAAGACTTTGCATCTAGG CCACAATTTTT
[0109] ACGGTGGTTCACCGAATGGAGTGATGAATTTTGTCAGGAACGGAAGAAATTGGAGGCAAAGGTTAAAGA ATATTGTAAGA
[0110] AGGATTATGTCGGATGTAATAAACAAAACACGAAGGCTAATAATAGTTGTGTTAGCGCTTGTGAAGCAT TTCAACATTAC
[0111] ATGAAGTCCAAAATGTCAGAATACGATACACAAAAAAAAAAATTTGAGGCTGAAAAAAGCGGGAAGGAA CCAGAATATGA
[0112] AGGTTTTTCAACTAAAGACGCTTCTGAATACTTAAAAGAAAAATGTTTGCATGGTACATGTGATTGTAT GGAGAAAGTAA
[0113] AAAACATTGATGATTATTGGAAAAATCCTCATAAAACGTATGACGATAACAAACTTGAAACTAAATGTG AGTGTCCTCAA
[0114] ACACCACCAAAACCATGTGAAATAGTAAAAACACTTTTGGAAGATAACAATGGAAGACATGTAGATGCT TGCAATCTCAA
[0115] ATATGAGGGTAAAAAAGAAAAACATACTTCATGGAATTGTAATCCAAATAAGTTTAAAAATGGAGAAGA AGGTGCCTGTA
[0116] TACCTCCGAGAAGACAAAAATTATACATATATAATTTAGAGAAATTCACTGGTGGAACATCAGAAATTG AATTGAGAAAA
[0117] GCTTTTATTGAATGTGCTGCAATAGAAACGTTTTTTTCTTGGCATAAATTTAAAAAGGATAAAGAAAGA GAGGATAAAGA
[0118] AAAACAAGATCTAGTAGGATATACATCAACCGTCGATGAAAAACATCAAAAGGATTTACAAAGTGGAAA AATTCCTGAAG
[0119] AATTTAAACGTCAAATGTTCTATACATTTGGTGATTATAGAGATATATGTTTAGGAAACGATATGGGTA ATGATAACTAT
[0120] AATAAAAATATATCTACAAAAGTTAGGAGTATTTTAAATAGTGGGGAAACACCTGAAGAATGGTGGCAA AAACATGGACC
[0121] TCAGATATGGGAAGGTATGTTATGTGCTTTAAGTTACGATACCGAAAAACAAAAAAAGGTTCAAGATGT GCACAATAATC
[0122] TTATAGCCCCCCCAAACAACAACAAGTACAACGACGTAAAATTGGTTTCGAAAAGTGGGAAACTTCATA CCTCTTTATCC
[0123] GATTTTGCAACTGTTCCGCAGTTTTTAAGATGGTTCGAAGAATGGGTCGAAGAGTTTTGTAGAAAAAAA AAAATTAAAAT
[0124] TGATAAAATTGAAGACGAATGTCGTGGAGAATATGATAATGGTGGTAAAAAATATTGTAGTGGTGATGG TTATGATTGTG
[0125] ACAAAAGATATTTATCCCATAATAAAATGTTTGCAGATTTAAATTGTCTAGGTTGTGAGAAAGAATGTA GAAATTATAAA
[0126] AAATGGATAGAAGAAAAAGTAGAAGAATTTTATAAAGAAAAAAAGAAATACGAAAAGGGGTTTGAGAAC ACACGAACTAA
[0127] CCTTGATAATAAATATGTTAAAGAATTTTATGAAACATCTGCTGGAAAATATAAGTCTGTTGACTTATT TTTAGATACAT
[0128] TGAAAGAAAGATCTCATTGTAGTATGGGTATGGTAAATAGAAAAATAGATTTTAAGAATCCGCTCGAAA CATTTTCCCCT
[0129] TCAATATATTGTAAAACGTGCCCTTTATATGGAGTTAACTGTAATTCGAGAGAATGTGTAGACATTACT GAAAATGAGTT
[0130] TAAGAAAAAAAATGTTTTAGATGAGATTATTATAAACGATAAGTCACATACAAGTATTGATATCGAAAT GATTGATCGTA
[0131] GGGGACAGTATATGCAAGAGAATTTAGACAATCCTTTGTTTAAAGAATCATATCTTTTAAAAAGTGTCA GAGATCAAAAA
[0132] TGGGATTGTAACTTTATTCATAATAAGATCGATTTATGTGAAATAAATAAGTTTAATGAAAACATAGAC ACTGATGAAAG
[0133] CATTACATTTAAGGTTTTGATAGAACGGTGGTTACMGATTTCTTAGAAGGATATTATATATCAAAAAA ACAAATCGATC
[0134] TATTTACAAAA AAAGAAGAAAATAAATGTGAATGCGTGAAGAAATGGGCAGAAAAAAAAGAAGGAGAA TGGGAAAAAATA
[0135] AACGAACATTTTAATAAACAAAAACATGATGATGCATTTGATATGGATTTTAAAGTCAAAAATTATTTT GAGAAAAATGC
[0136] AAGTGATTTAAAGGATTGGATAGATAATTTTAAACGTCTAAACAATATAGATGATTATCAGGTTTGCAA TGTTCATAACA
[0137] ATTGTAAAAGTGCGGATAAAAAAAATAAAATAGATATGGTATCTATTTTACTTTCTGAGCTTAAAAAAG AAATAGAAACT
[0138] TGTAAAAATCAAGGTAACGAAAAAACAAAAATAAAATGTGATGCATCACCTACAAACGACGAACTAGAT GAAGAATACGA
[0139] ACTAGGCACAACGGACACATCTCCATCCGCAGCTCCGGATATTTGTAAGGATGTGATCCAAAGTAAATC TGAAGAAACAA
[0140] TATGTAGAGATGATAAAAGGGTAGATTGTAACAAGGTGGGTAAAGATGATCCAATAAAGGTCCCTATGG ATCCAAAATCT
[0141] GGTGAAGATCATCTCAACGAGATGGGAGATAAACATAATTGTAGTGGAATTATCATTAAAACAAATGGT GAATGGAAAAA
[0142] TACAAAACAATTAAATTACCCGAACCCATGTGAAAGCATATATGCTTCACCTCGAAGACAAAAATTCTG TGTACATGAAC
[0143] TTGACAAAGCAAAAAACCAAAAGGAATTAAGAACTAAATTATTGACTGTTGCTGCAAATCAAGGATATA ATCTAGCTATT
[0144] AAACATCATGAATATAAAGACAAATATACTGTTAATCCTTGTAATGCATTGAAATATAGTTTTTACGAT TATCAGCATAT
[0145] AATTCTAGGAGATGACCCGATGGAACCTGAAAAATGGGATACGGAAAGTGCATTGAAAAGAATATTTGG AAATAGAAATA
[0146] CAGAAGATGCCAAACCTCTTAGTAGAAAACGTAAAGATTTTTGGAAAGAAAACAAAGAATGCGTTTGGT CAGCAATGAAA
[0147] TGTGGTTACAACGAAGGAATAAAAAAGGGTAATAAGAGTAATAATATTCCAGAATGTAAGGACAGTATA CCTACCCAATT
[0148] TGATGGTGTTCCTCAATTTTTGATGTGGTTTACTGAATGGAGTGAAGATTTTTGTAATCATAAGAAGAC ACATTTGAAAA
[0149] AATTGGAGCAGGGGTGTAGGGGATGTACTCTTCGTATTGATGGCACATGTGAGAAAGATGGCTCAGGAT GCCAAAAATGT
[0150] TCACAAGCGTGTGAAGAATATAAAGCATGGCTTCAAAATTGGAAAGACCAATATAAGAAACAAAGCAAA AAATATAGTGG
[0151] TGATAAAAAAAAAGAGCTATATAAAACTGTTCCTAAAGTAAAAAATTCAACACATGCCTATGAATATTT ACAAACACAAT
[0152] TAGAAAAACTTTGTGAAAAAGGTAAATGTGATTATACTTGTATGAAMACCCATCGACAGAAAATAGTA CTGAAAATATG
[0153] CCCGAATCATTGGACGTAAAACCCGATATAGTTAAGGATAAATGCCCTTGTCCACCACAGAAAATAGAA AAACCCGATTC
[0154] CACATTAAATTGCATAGATAGAAGTGCATTTGAATTATATGCAAAAGCAAAAAGTGATTTACATGGTGT AAAAGATAAAT
[0155] TAAAGGGTAATAATACAAAAAATATATACGAAGAAACAACTAATGGTAAAAATGATGATAATATTATCT GTAAAATTAAT
[0156] GAGAGTATTTCTAAACAAAACAATGTATGTAAAAAAAATGAAAATCTTTTTGATGATATAGACAAATGG GACTGTAAAAA
[0157] ACGAACAAATACAGTGCCCATTGAAAATATATGTATTCCTCCAAGAAGGAAACTTATGTGTGCATATCC ATTAAAAAATT
[0158] TAGGAGTAAAAAAAAATACTTCAGAAGTATTGTTCAACAAAGTATTGCGTACAGCAGCATATGAAGGAA AACATATAAAG
[0159] GAATCATGGGAAAAAGCAGAAAAATCCAAGAAAAAAAAAACCCAAATATGTGATGCTATGAAATACAGT TTTGCAGATTT
[0160] AGGAGATATAATTAGAGGAAGAGATATATTGATATTTAATAATGGTAATAATGAAATTGAGAGAGACTT AAAAGCTGTTT
[0161] TTCAGTCAATATACGATAAATGGAAATCTGACAGTAATAATAATAAAGATAAATACCCCGACTTAACCT CTTTTCGTTCT
[0162] GCCTGGTGGGATGCTAATAGAAAAGATATTTGGAAAGCTATGACATGTGGTGCACCGGAAGATGCTACG CTTTTTAAAAA
[0163] ACTAGAAAAATGGGGAATTCCTAATTTAATTTTGTCACAACATAAATGTGGGCATAATGACGATCCTCC TATTGATGATT
[0164] ACATACCTCAACGGTTAAGATGGATGAAGGAATGGGGAGAATATGTTTGCAAAATATTAAATGAAAACG TGAATCATATG
[0165] AAGAACGATTGTGATAAATGTACACTAAATGATAAAAAATGTTCAGATGAAGATGATGGTAATAAATGT AGAAGTTGTAA
[0166] AGAAAAATGTAAAGAATATACTAAACTTATATACAATCTGAAATCACAATTTTATATACTAGAAAAACA TTATAACGAAT
[0167] TATATACAAAAGCACAAAATAATACAACATATTTTACAAATGATAACGATAAAAAGGTTATTGAATTTT TTAAAAAAGTT
[0168] AAAAAGGATTGTGATGTGGGAACTCCTGATAAATATCTCGATAAAGCTATTCATTGTATCCATTATGAT TTTACTAAAAA
[0169] TGGAACCAAATCTAAGCCATATGTCTTCAACAATCAACCAGAAAAGTATAAAAATCTTTGTAGTTGTAC TATTACTAATC
[0170] ATCCGTTAGACAAATGTCCTTTACCTGATAAAACAGATGATTATTGCAAAATCATTAGACATATTAATC CGTGTATAACA
[0171] ATAAATTTGGATAATAATTTGGATACGTGGACTGGATTTGTTGTGCATAATATAAGTCACAAAAATAAA GGTGTGCTTGT
[0172] ACCTCCAAGAAGAAGACATTTATGTACAAGAGAATTAACTGGAATTAGATATCGTAAAAATGATAAAGA TAATTTGAAAC
[0173] AAAATCTTATTGATTCTGCTTTTAATCAAGGAATACTTTTAGGAAAAACATTTAAAGATTACAGCGATC AAGGTTTGGAA
[0174] TATATGAAATATAGTTTTGCTGATTATGGAGATATAATTAAAGCTAAAGATATGATAGGAGGTTCAAAT ATTGATGATTT
[0175] CAATAATGATTTAAAAAAATGTTTCCAGAACATCATAGTGAGAATATGGGAAAAACTACTATTAGTCGT GAACAGTGGT
[0176] GGGAAGCAAATAAAACACACGTATGGCACGCTATGTTATGCGGGTATCATCAAGGAATAATTAATCCAA ACTTATCAAGA
[0177] AGAAGACCAAAACCATTAGAAGAAGGAACACAATCGTCGATAGCAACTAAAACTATTCCTTCAAATTGG TGTCAATTACC
[0178] TAATGATTATAGCACTGATCAGTTTCTTCGTTGGTTTCAGGAATGGATTGAAAATTTTTGTACAAGGAA AAAAGTATTAG
[0179] AGAAAGAAGCACAAGAACAATGTAAGAATATTACATGTAATAACGATACTGGAAAAACGAACACTAAAT GTACTGAAGCA
[0180] TGTAAAAATTATAGTAATTTTATTTTAATAAAAAAAAAGGAGTATGAGTCACTAAATAGTCAATACGAT ATGAATTATAA
[0181] AAAAATAGTAGAACATAAAAATGCCCTAGAATATTTCAAAGATAAATGTAAAAATAATTGTGAATGTCT CTCTAAACATA
[0182] TTGATAATGGAAAAAATTGGAAAGAACCATATGAAACTATCGATGACTCAGAACTCATAGGTAAATGTA AATGCAAAAAA
[0183] GTTAAACCCAAAACTCCTGACGTAATTCCTGCAGGGGCAACTGAAACAAAAGAAAAAGATACACCTCAT GCACCTGAAAA
[0184] ACCTCAACAACCCCCACAACCCTTACCACCATCCGACGAACCCTTTGACCCGACCATCCTACAAACGAC CATTCCTTTTG
[0185] GAATCGCTTTGGCATTAGGATCGATAGCGTTTCTTTTCATGAAAaaaaaacCgaaatctccagttgacc tcttacgtgta
[0186] ctgaatatcccgaaacgagattatgaaatgcctacgttgaaatcaaaaaatcgatatataccctatgct agtgatcgata
[0187] taaaggtaaaacatacatttatatggaaggagatagcagtggagatgaaaaatatgcatttatgtctga tactactgatg
[0188] taacttcctcagaaagtgaatatgaagaattggatattaatgatatatatgtaccaggtagtcctaaat ataaaacattg
[0189] atagaagtagtattggaaccatcaaaaagtaatggtaacacactaggtgatgatatggtacctaccact aatacatttac
[0190] agatgaggaatggaatgaattgaaacatgattttatatcacaatatgtacaacgtgaaccactggatgt accacaatatg
[0191] atgaatcaacacagttaccaatgaatatagtaggtaacgttttagatgatggtatggatgaaaaacctt ttattacttct
[0192] attcatgatagagatttatatactggagaagaaattagttataatattaatatgagtactaatagtatg gatgatccaaa
[0193] atatgtatcaaataatgtatattctggtatagatttaattaatgatacattaagtggtgatcgtattga tatatatgatg
[0194] aattattgaaacgaaaagaaaatgaattatttggtacaaatcatgtgaaacaaacaagtatacatagtg ttgccaaacta
[0195] acaaatagtgaccccatccacaaccaattagatttgttccatacatggttagatagacatagagatatg tgcaatacgtg
[0196] gaataccaaggaagaattattagataaattgaatgaacaatggaataaagataatgatggtggtgatat accaaatgata
[0197] acaaaaagttgaatacggatgtttcgtttgaaatagatatggatgaaactaaaggaaagaaggaattta gtaatatggat
[0198] actatcttggatgatatggaagatgatatatattatgatgtaaatgatgaaaacccatctgtggataat atacctatgg
[0199] atcataataaagtagatgtaccaaacaaagtacatgttgaaatgaaaatccttaataatacatccaatg gatcgttgga
[0200] acaagaatttcccatatcggatgtatggaatatataa
[0201] 定名为TM284varl的PfEMPl变体具有以下氨基酸序列：
[0202] SEQ ID NO :3
[0203] MTSKRGNRTVINLSVTDVLEKIALQIYKEENEKKIPHESELTGTLWKAQFSDGLSGSFGDVRSGPSNSC NLHHKYYTNIK
[0204] NGYPPARNPCDGRNEKRFSNEGEAECGSDKIRVIGKGDGTACVPFRRQNMCDKNLEYLINKNTKTTHDL LGNVLVTAKYE
[0205] GASIVAKHPHKDTSEVCTALARSFADI⑶IVRGRDMFLPNKDDKVQKGLREVFKKIHDNLSSSVKPHYK DDGSGNYVKLR
[0206] EDffffAINRKEVWNALTCEAPQSVHYFIKTSHGTRGFTSQGKCGRNETNVPTNLDYVPQYLRWFDEffAEE FCRLRNHKLQN
[0207] VKKECRGENI⑶KYCS⑶GEDCEKIVRQDYNIRSDFLCPSCKKECTNYKKWIDTKQGEFNKQKKKYEKE IKKVESNSDTT
[0208] YDKKVYKILKEMYPLNSEFVATLKEAPYCNNNNVDGTIDFNKPDDTFSRSDYCKSCPVFGVICTRGECT EVKEDTCSKMN
[0209] VKVPKKITNKEDPINIGILVSDDRVSVIPNELENVCKDTGLFKGIRKDQRSCNYLCNLDVCDLSHNKNN THIDKRISIRV
[0210] LFKRWLEYFFKDYSKLKKKLNSCTNNGEKSICINKCKKKCECVGKWVEEKRTEWEKVRKRYFSQYNVDD SQKSYTVKSIV
[0211] NGNVDRSDINNSLDESEDIETLKESDTCYNSDSAKKQKCEKNDVITILIDRLKKKIDDCEKQHDNRTNQ ICCDELPESKE
[0212] DDEDEEEEGKKKKNAKQLEVTNEKKEQEDKNLFQVCQKMKKVITDNNGERIRNQRCNEKTDRKWDCSTN EIPTNHTGACM
[0213] PPRRISLCIRPLRYLVDNGGKKSIDDYKNAFTECASIETYLLWQKYKRTNGAEDKLKDGEIPNDFLRIM YYTYGDYRDIF
[0214] LGTDISKNPNIKNISNKVKNILKFKKSMDESGKNQDENAKVQSSWDEHKRDIWKGMLCGLTYDIQNEKK DILKILNNKYN
[0215] YPCDLEVFASKPQFFRWFIEWAEDYCRKYNDEYEKLQTACSTVDCSKDPTDSEKWKCKNACDNFKTFVE GWKKQYDSQKN
[0216] KFNKIKIEANIKNTYKGIENKEAYVFLSEECKGKCDCIKYKTDYDTNANDPKGFDTPPKEQKDMCECVL· RKKSACENNEV
[0217] PKGRTQSQMTCADLKNESPSKGNNNTGNNHKETITFSCNKSNLIGLGAQWKKITDDGLYASPRTRQLCL KHVIDIGRNNT
[0218] KKNNITEEEFINVLQKDAYAEGKLLYMYYNSNGKISIFQNGEKLKLDDIEKHTHEAMKRSYADY⑶LIK GTTKYTQYNDY
[0219] NKISDIINWWTKKKNSASINDIYEREEFWEKYRADVWNAMLCGYKDVSNKTFDGNDDMCNLPNTDKEEE FLRWFKEWNEN
[0220] FCITQIKRAEKLKNECNNFNCSSIKSKKDDIKSKCVKAVINYKKFVKESKTQYEDQKRTYNERHNKTNK DIPTFLKDNCI
[0221] HKNCDCISIKFNHKDNWEKSFFESLDSSDIKNKCECLKLEEESNTTERYISKEDPQYHPEYK⑶GKVNY KYEKGKPKALP
[0222] SIYPLNCAEKVADELRMYAENSLDTNTKLKAKISKSIDTNEQNATNDEIDCNIYNNISNGQKNTCEHNG NTFHDKDEWDC
[0223] NKGTNKLYENDICLPPRRKHMCTKQLENISTASITTTDDLLKEVLITAVNEGKRLKQQWEKTENEAQKK KHFLCDAMKYS
[0224] FADLADIIRGTDIWKGNREQQKIQERLVKIFRNIYDNLEKDEYEKYKYGTKYQNLRSAffffDAHRKKIWN AMTCSAP⑶FL
[0225] FVKRGKGDGSDIEFLTFSEHKKCGHDKEPPVYDYVPQILRWITEWSEHFCELQEKNYYLLKEKCADYIQ KDSKPIDDSHN
[0226] IKCNTCKTKCEEYSKFIKKWNSQYINLEKKFKELYDEANNTKSYEELYRIGKPSHRNHYEDENLIQFLQ NVKSECNEPNT
[0227] VDKYLMYTSDCRRVKFSNTIDTNVNKPTADVTHNTINGPSSNLPVVTETNIKNELREYAFLETPEGYGN ACKCKGPEPLD
[0228] RCPENDNISNYCNDFVSVPECTAKIYKDEIDHWNNANVKFKTSINNGVLVPPRRSHICLKNMITKNYDK KKNGMEKFKTD
[0229] LLQVAYNEGYFLCQKYDKQPRDVLEAMKYTFADIADIVKGRDMINKDISAKLRKLLDIKVEPKAPRKffff KYNKAHVWHAM
[0230] LCGYRKGGGTITNDECNVPFEEYTYQFLRWFQEWIKKGCTGQQKLYDDVWTKCSSANCNRDDGTISLPE CESSCVQYKNY
[0231] ITRKRQEYRSLNHQYNMNFKEQKAQGMKATQYIDDKCNSKCDCLIKYIDREKEWTNIYDSLENNDLKNK CDCKQIKPKRH
[0232] PKEVNPEEEPANSEPDYIVPLVPQKPSTPEVPPPPPPPLPTPSDEPFNRDILEKTIPFGIALALCSIAF LFIKKKPKSSV
[0233] DLLRVIDIHKGDYDIPTLKSKNRYIPYKSAQYKGKTYIYME⑶SDSGHYYEDTTDITSSESEYEEMDIN DIYVPGSPKYK
[0234] TLIEVVLEPSKRDTQNDIPSDNTPSYKLTDEEWNQLKHDFISQYLPNTEPNNNYRSGNSPTNTNNTTTS HDNMGEKPFIT
[0235] SIHDRDLYTGEEISYNINMSTNTNNDIPKYVSNNVYSGIDLINDTLSGNKHIDIYDEVLKRKENELFGT NHPKNTSNNSV
[0236] AKLTNSDPIMNQLDLLHKWLDRHRDMCDKWNTKEELLDKLNEQWNKDNDVGGDISTSNGNKTLNTNVSI EIDMDETKGKK
[0237] EFSNMDTILDNIEDDIYYDVNDENPSMDDIPMDHNKVDVPKKVHVEMKILNNTFNGSLEPEFPISDVWN I
[0238] 此外，TM284varlPfEMPl变体由以下核酸序列编码：
[0239] SEQ ID NO ：4
[0240] ATGACGTCAAAACGTGGAAATCGAACTGTAATTAATCTTAGTGTAACGGATGTTCTAGAAAAAATTGCA TTACAAATATA
[0241] TAAAGAGGAAATGAAAAAAAGATTCCACATGAAAGTGAATTGATAGGCACATTATGGAAAGCACAATTT TCTGATGGCT
[0242] TGAGTGGTTCATTTGGTGATGTAAGGTCTGGTCCTTCAAATTCCTGCAATCTTCATCACAAATACTATA CTAATATAAAG
[0243] AATGGATATCCACCCGCAAGGAATCCTTGCGATGGTAGAAATGAAAAACGTTTTTCAAACGMGGTGAA GCAGAATGTGG
[0244] TAGTGATAAAATAAGGGTTATTGGAAAAGGTGATGGTACAGCATGTGTACCATTTAGAAGGCAAAATAT GTGTGATAAAA
[0245] ATTTAGAATATTTGATTAATAAAAACACGAAAACTACTCATGATTTATTGGGAAATGTATTAGTTACAG CAAAATATGAA
[0246] GGTGCCTCTATTGTTGCAAAGCATCCACATAAAGATACTTCAGAAGTATGTACTGCACTTGCACGAAGT TTTGCAGATAT
[0247] AGGTGATATTGTAAGAGGAAGAGATATGTTTTTACCTAATAAGGATGATAAAGTACAAAAAGGTCTAAG AGAAGTTTTCA
[0248] AGAAAATACATGATAATTTGTCATCTTCCGTAAAACCACATTACAAAGATGATGGATCTGGAAATTACG TCAAATTAAGA
[0249] GAAGATTGGTGGGCAATTAATAGAAAGGAGGTATGGAATGCATTAACATGTGAAGCTCCACAAAGTGTT CATTATTTTAT
[0250] AAAAACGTCACATGGAACAAGAGGTTTTACAAGTCAAGGAAAATGTGGCCGTAATGAAACAAACGTTCC TACAAATCTTG
[0251] ACTATGTTCCTCAATATTTACGCTGGTTCGATGAATGGGCAGAAGAGTTTTGTCGATTAAGGAATCATA AGTTACAAAAC
[0252] GTTAAGAAAGAGTGTCGTGGAGAAAATATAGGTGACAAATATTGTAGTGGTGATGGTGAGGATTGTGAA AAGATTGTTCG
[0253] TCAGGATTATAATATTCGTTCGGATTTTTTATGTCCGAGCTGTAAAAAGGAATGTACAAATTATAAAAA ATGGATAGACA
[0254] CAAAACAGGGAGAATTTAATAAACAGAAAAAAAAATACGAAAAAGAAATTAAAAAAGTTGAAAGTAATT CTGATACCACA
[0255] TATGATAAAAAAGTTTATAAAATTCTAAAAGAAATGTACCCTTTAAATTCAGAATTTGTAGCAACATTA AAAGAAGCTCC
[0256] CTATTGTAATAACAATAATGTAGACGGTACAATAGATTTTAATAAACCAGATGATACATTTTCTCGTTC AGACTATTGTA
[0257] AATCATGTCCTGTATTTGGTGTTATTTGTACAAGAGGTGAGTGTACTGAAGTTAAGGAAGATACATGTA GTAAAATGAAT
[0258] GTTAAGGTTCCGAAAAAAATTACAAATAAGGAAGATCCTATTAATATAGGTATTCTTGTTAGTGATGAC AGAGTAAGTGT
[0259] AATTCCAAATGAATTAGAGAATGTTTGCAAAGATACAGGTCTCTTTAAAGGTATTAGAAAAGATCAACG GTCATGTAATT
[0260] ACTTATGTAATTTAGATGTATGTGACCTGAGTCATAATAAAAACAATACACATATAGATAAACGTATTT CTATTAGAGTA
[0261] TTGTTTAAACGTTGGTTAGAATATTTTTTTAAAGATTATAGTAAATTAAAAAAAAAACTGAATTCATGT ACAAATAATGG
[0262] AGAAAAATCCATATGTATAAATAAATGTAAAAAAAAATGTGAATGTGTGGGAAAATGGGTAGAAGAAAA AAGGACAGAAT
[0263] GGGAAAAAGTAAGAAAGCGTTACTTCAGTCAATATAATGTTGATGATTCACAAAAATCGTATACAGTGA AAAGTATTGTA
[0264] AATGGAAATGTAGATCGTAGTGATATTAATAATTCATTGGATGAGAGCGAAGATATAGAAACGTTGAAA GAATCAGATAC
[0265] ATGTTATAATTCTGATAGCGCAAAAAAACAAAAATGTGAAAAAAACGACGTCATAACTATTTTAATTGA TAGACTTAAAA
[0266] AAAAAATTGATGATTGTGAAAAGCAACATGATAATAGAACTAATCAAATTTGTTGTGATGAGTTACCTG AAAGTAAAGAA
[0267] GATGATGAAGATGAAGAGGAAGAAGGGAAAAAGAAAAAAAATGCAAAGCAATTGGAAGTAACTAATGAG MAAAAGAACA
[0268] AGAAGACAAAAACTTGTTTCAAGTGTGCCAAAAAATGAAGAAGGTAATTACGGATAATAATGGAGAAAG AATCAGAAACC
[0269] AGCGTTGCAATGAAAAAACTGATAGAAAATGGGATTGTAGTACTAATGAAATTCCTACAAATCATACTG GAGCTTGTATG
[0270] CCACCAAGAAGAATATCATTATGTATTCGGCCTTTACGATATTTGGTAGATAACGGAGGAAAAAAAAGC ATAGATGATTA
[0271] TAAAAATGCGTTTACTGAATGTGCATCAATAGAAACGTATTTGTTATGGCAAAAATACAAAAGAACTAA TGGAGCAGAAG
[0272] ATAAATTAAAAGATGGAGAGATTCCAAATGATTTTCTAAGAATAATGTATTATACATATGGAGATTATA GAGATATATTT
[0273] TTGGGAACAGATATTTCTAAAAATCCTAATATTAAAAAATATATCAAATAAGGTTAAAAATATATTGAA ATTCAAAAAGAG
[0274] CATGGACGAATCAGGTAAAAATCAGGATGAAAATGCGAAAGTTCAATCTTCGTGGGATGAACATAAAAG GGACATATGGA
[0275] AAGGAATGTTATGTGGATTAACCTATGATATCCAAAATGAAAAGAAAGATATTCTCAAAATTCTCAATA ACAAGTACAAT
[0276] TACCCATGCGATCTTGAAGTGTTTGCATCTAAACCACAATTTTTTCGTTGGTTTATTGAATGGGCAGAA GATTATTGTAG
[0277] AAAATACAATGATGAGTATGAAAAATTACAGACGGCGTGTAGTACGGTAGATTGTAGTAAAGACCCTAC TGATTCTGAAA
[0278] AACAAAAATGTAAAAACGCTTGTGATAATTTCAAAACATTCGTTGAAGGTTGGAAAAAACAATATGATA GTCAAAAAAAT
[0279] AAATTTAATAAGATAAAAATTGAAGCTAATATAAAGAATACATATAAAGGTATAGAAAAATAAAGAAGC TTATGTATTTTT
[0280] AAGTGAAGAATGTAAAGGAAAATGTGACTGTATAAAATATAAAACAGACTATGATACAAATGCAAATGA TCCTAAAGGTT
[0281] TCGATACACCACCGAAAGAACAAAAAGATAATTGTGAATGTGTGTTGAGAAAAAAATCGGCATGTGAAA ATAATGAAGTA
[0282] CCTAAAGGTCGAACACAATCTCAAATGACATGTGCTGATCTAAAAAATGAATCTCCTAGTAAAGGAAAT AATAATACTGG
[0283] GAACAATCATAAAGAAACCATTACATTCTCGTGCAATAAAAGCAATTTAATTGGCTTAGGAGCACAATG GAAAAAAATAA
[0284] CTGATGATGGTTTATATGCTTCTCCAAGAACTCGACAATTATGTTTGAAACACGTAATAGACATAGGAA GGAATAATACT
[0285] AAAAAAAACAATATAACAGAAGAAGAGTTCATTAATGTATTACAAAAAGATGCATATGCTGAAGGTAAA TTACTTTATAT
[0286] GTACTACAACAGTAATGGTAAAATATCTATATTTCAAAATGGCGAAAAGTTAAAATTGGATGACATAGA AAAACATACAC
[0287] ATGAAGCCATGAAAGATCATATGCTGATTATGGTGATTTAATTAAAGGAACAACAAAATATACACAATA CAATGATTAT
[0288] AACAAAATTAGCGATATTATAAACGTTGTGACTAAAAAGAAAAATTCCGCTTCAATTAATGATATTTAT GAGCGTGAAGA
[0289] ATTTTGGGAAAAATATAGAGCTGATGTATGGAATGCTATGTTATGTGGTTACAAAGATGTATCAAATAA AACATTTGATG
[0290] GAAACGATGATATGTGTAACTTACCAAATACTGATAAGGAGGAAGAATTTCTCAGATGGTTTAAGGAAT GGAATGAAAAT
[0291] TTTTGTATTACACAAATAAAACGCGCAGAGAAATTAAAAAATGAATCCAATAATTTTAACTGTTCTTCC ATTAAGAGTAA
[0292] AAAGGACGATATTAAATCTAAATGTGTAAAAGCATGTATAAATTATAAAAAGTTTGTAAAGGAATCAAA AACGCAATATG
[0293] AAGATCAAAAGAGAACATACAATGAAAGACATAATAAGACAAATAAGGATATTCCTACTTTTTTGAAAG ATAATTGTATT
[0294] CATAAAAACTGTGATTGTATTTCTATAAAATTTAATCATAAAGATAATTGGGAAAAAATCTTTTTTTGA GAGTTTAGATAG
[0295] TTCCGATATTAAAAATAAGTGTGAATGTTTAAAACTTGAAGAAGAGTCAAATACTACAGAACGATATAT TTCTAAAGAAG
[0296] ACCCACAATATCATCCAGAATATAAAGGTGATGGAAAGGTTAATTATAAATATGAGAAAGGAAAACCAA AAGCTCTTCCT
[0297] TCTATATACCCTTTGAACTGTGCTGAAAAGGTTGCTGACGAGTTACGAATGTATGCTGAAAATTCTTTG GATACTAATAC
[0298] TAAATTGAAGGCAAAAATATCAAAAAGTATAGATACAAATGAACAAAATGCTACGAATGATGAGATTGA TTGCAATATTT
[0299] ACAATAATATATCTAATGGACAGAAAAATACTTGTGAACATAATGGAAACACTTTTCATGATAAGGATG AATGGGATTGT
[0300] AACAAAGGAACAAATAAATTATATGAAAATGATATTTGTTTACCTCCAAGAAGAAAACATATGTGTACA AAACAACTAGA
[0301] AAATATCAGCACGGCATCAATTACAACTACGGATGATTTACTGAAAGAAGTGTTAATTACAGCTGTAAA TGAAGGAAAGC
[0302] GTTTAAAACAGCAATGGGAGAAAACAGAAAATGAAGCACAAAAAAAGAAACACTTTTTATGTGATGCTA TGAAATATAGT
[0303] TTTGCTGATTTAGCTGATATTATAAGAGGAACAGACATATGGAAAGGAAATAGAGAGCAACAAAAAATA CAAGAAAGATT
[0304] AGTAAAAATCTTCAGAAATATATATGATAACTTAGAGAAGGATGAATATGAGAAATATAAATATGGTAC AAAATATCAAA
[0305] ATTTAAGATCGGCTTGGTGGGATGCACATAGAAAGAAAATATGGAATGCTATGACATGTTCAGCACCAG GTGATTTCCTT
[0306] TTTGTAAAAAGAGGAAAAGGAGATGGAAGTGACATCGAATTTTTAACTTTTTCAGAACATAAAAAATGT GGACATGATAA
[0307] AGAACCACCTGTTTATGATTATGTGCCTCAAATACTTAGATGGATTACAGAATGGTCTGAACATTTTTG TGAATTGCAAG
[0308] AAAAAAATTATTATCTTCTAAAAGAAAAATGTGCTGATTATATACAAAAGGATTCCAAACCTATTGATG ATTCACATAAT
[0309] ATAAAATGTAATACTTGTAAGACGAAATGTGAAGAATATAGTAAATTTATTAAGAAATGGAACTCTCAG TATATAAATCT
[0310] GGAAAAAAAATTTAAAGAATTATATGACGAGGCAAATAATACTAAAAGTTATGAAGAACTTTACAGAAT TGGGAAGCCTT
[0311] CACACAGAAACCACTATGAAGATGAAAACCTGATTCAGTTCTTACAAAATGTAAAATCTGAGTGTAACG AACCTAACACT
[0312] GTTGATAAATATCTTATGTATACAAGTGATTGTAGAAGAGTTAAATTTTCTAATACTATCGATACAAAT GTTAACAAACC
[0313] TACTGCGGATGTTACTCATAATACTATTAATGGTCCTAGTAGTAACCTCCCAGTTGTTACTGAAACAAA TATTAAAAATG
[0314] AACTAAGAGAATATGCTTTCTTAGAAACACCAGAAGGATATGGTAATGCTTGTAAATGTAAGGGTCCTG AACCATTAGAT
[0315] CGTTGCCCTGAAAATGATAATATTAGTAATTACTGTAACGATTTTGTTAGTGTTCCTGAATGCACAGCA AAAATATATAA
[0316] AGATGAAATTGATCATTGGAATAATGCAAATGTAAAATTTAAGACATCAATAAATAACGGTGTGTTAGT TCCTCCAAGAA
[0317] GAAGTCATATATGTCTTAAGAATATGATAACAAAAAACTATGATAAAAAGAAAAATGGGATGGAAAAAT TTAAAACTGAT
[0318] CTTCTACAGGTTGCATACAATGAAGGTTATTTCCTATGTCAAAAATATGATAAGCAACCTAGAGACGTA TTGGAAGCGAT
[0319] GAAATACACATTTGCAGATATTGCTGATATAGTAAAAGGTAGAGATATGATTAACAAAGATATATCCGC AAAACTACGAA
[0320] AATTATTGGATATTAAGGTTGAACCCAAAGCTCCTAGAAAATGGTGGAAATACAATAAAGCACATGTAT GGCACGCTATG
[0321] TTATGTGGATATAGAAAAGGTGGAGGAACAATTACGAATGATGAGTGTAATGTTCCAGATGAAGAGTAC ACTTATCAATT
[0322] TCTTCGATGGTTTCAAGAATGGATTAAAAAATTTTGTACTGGACAACAAAAATTATATGACGACGTACA AACGAAATGTT
[0323] CATCTGCCAATTGTAATAGAGATGATGGGACGATTAGCCTACCTGAATGTGAAAGTTCTTGTGTTCAAT ATAAGAATTAC
[0324] ATTACAAGGAAGAGACAAGAGTATCGGTCACTAAACCATCAATATAACATGAATTTTAAAGAACAAAAG GGACAAGGTAT
[0325] GAAAGCCACACAGTACATAGATGATAAATGTAATAGTAAATGTGATTGTCTCATTAAATATATTGATAG AGAAAAAGAAT
[0326] GGACAAACATATATGACTCATTGGAAAATAATGATCTGAAAAATAAATGTGATTGTAAGCAAATTAAAC CCAAACGTCAT
[0327] CCAAAAGAAGTAAATCCTGAGGAAGAACCTGCTAATTCTGAACCCGATTACATTGTTCCCCTTGTACCA CAAAAACCTTC
[0328] AACACCAGAGGTACCCCCACCTCCTCCTCCACCTTTACCAACCCCTTCGGACGAACCATTCAATCGTGA CATTCTGGAAA
[0329] AAACCATTCCTTTTGGAATTGCATTGGCATTATGTTCGATAGCTTTTCTCTTCATAAAGaaaaaaccta aatcatctgtt
[0330] gacctcttgcgagtaattgacatccacaaaggagattatgatatacctacattgaaatccaaaaatagg tacataccata
[0331] taaaagtgctcaatataaaggtaaaacatacatttatatggaaggagatagtgatagtggacactacta cgaagatacaa
[0332] ctgatattacttcctccgaaagtgaatatgaagagatggatattaatgatatatatgttcctggtagtc CcLcLcLcL^cLCcLcLcL
[0333] acgttgatagaagttgttctggagccatcaaaaagagatacacaaaatgatatacctagtgataataca cctagttataa
[0334] acttacagatgaggaatggaatcaattgaaacatgattttatatcacaatatttaccaaatacagaacc βββ?ββ?ββ--
[0335] atagaagtggaaatagtccaacaaataccaataatactaccacgtcacatgataatatgggagaaaaac cttttattact
[0336] tctattcatgatagggatttatatactggagaagaaattagttataatattaatatgagtactaacact aataatgatat
[0337] tccaaaatatgtatcaaataatgtatattctggtatagatttaattaatgacacattaagtggtaacaa acatattgata
[0338] tatatgatgaagtgctaaaaagaaaagaaaatgaattatttggaacaaatcatccgaaaaatacatcaa acaatagtgta
[0339] gctaaattaacaaatagtgatccaattatgaaccaattagatttgttacataaatggttagatagacat agagatatgtg
[0340] cgataaatggaataccaaggaagaattgttagataaattaaatgaacaatggaataaagataatgatgt tggtggtgata
[0341] tttccactagtaatggtaataaaacgttgaatactaatgtttcgattgaaatagatatggatgaaacta aaggaaagaag
[0342] gaatttagtaatatggatactatcttggataatatagaagatgatatatattatgatgtaaatgatgaa aacccatctat
[0343] ggatgatatacctatggatcataataaagtagatgtacctaagaaagtacatgttgaaatgaaaatcct
[0344] tcaatggatccttggaaccagaatttcccatatcggatgtatggaatatataa
[0345] 定名为ITvar60的PfEMPl变体具有以下氨基酸序列：
[0346] SEQ ID NO :5
[0347] MAPKGRSTNEIELSARDVLENIGIGIYNQEKIKKNPYEQQLKGTLSNARFHDGLHKAADLGVIPGPSHF SQLYYKKHTNN
[0348] TKYYKDDRHPCHGRQGKRFDEGQKFECGNDKIIGNSDKYGSCAPPRRRHICDQNLEFLDNNHTDTIHDV LGNVLVTAKYE
[0349] GESIVNDHPDKKNNGNKSGICTSLARSFADI ⑶ IVRGRDMFKPNDKDAVRHGLKWFKKIYDKLSPKVQ EHYKDVDGSGN
[0350] YYKLREDffffTANRDQVWKAITYKAPQDANYFRNVSGTTNAFTSAGKCRHNDNSVPTNLDYVPQFLRWYD EWADDFCRIRN
[0351] HKLQKVKDTCQGYNNSGYRIYCS⑶GEDCTNILKQNFNIVSDFFCPSCKTECTNYKKWINKKQGEFNKQ KKKYEKEINNI
[0352] ASNSDNTYDKKVYKTLKSMYPLDTKFVATLKEAPFCNNNNVDGIIDFNKPDDTFSSSTYCDSCPAFGVI CENGTCTKVNE
[0353] DTCSKMNVQVPKIITNKEDPTNIGILVSDDRVNVIPNELENVCKNTGIFKGIRKDEWSCKYLCNLDVCD LSHNKNNTHID
[0354] KRISIRVLFKRWLEYFLKDYSKLKKKLNSCTNNGKESICINECKKKCECVGKWAEEKRKEWEKVRKRFF NQYNVDDSLKS
[0355] YEVKTFVNGNVDRSDIKNALNEGENLEALQDSDECIKPHNSKKDTCVKNDVVNILINRLKKKIDDCKIQ HDNRTNQICCD
[0356] ELPESKEDNEDEEEEGEKKKNSKHLEETKEKKELDDNNFLDLCNNVKKYIEDNNKQISIQHKCNTKGDG NWNDSTKKIDI
[0357] QHTGAHMPPRRKSLCIRELRYLVEIGGDKNIDDYKNAFTKCASIETYLLWQKYKKSNRSEEDKLKGGEI PEDFRGIMYYT
[0358] F⑶YRDIFLGTDISSDGNIKNISNKIKDLMKEKYSKATGHKGENHNSNLQSSWDEHKRTIWKGMLCGLT YGISNEQQKKN
[0359] IRKMLNNKYKYPCDLETFSKKPQFLRWFNEWSEDFCKNYKNAIDILKKDCTEADCMNKLVNNREKNKKC KEACEHFKEWI
[0360] KGWKNQYEQQRKKFNIDKNVEQKETAYINVNGLEPYEFFQNQYFVGTCECMKNKSESSANNDENIPEAF DEKPKEFKDKC
[0361] PCTYDIPEPSETMSCIEKAAFKLRYASEDKIHSKISSKLKGNGSAFSCTNSASDNIFDETSCYKNEFNK TENINSVKASN
[0362] MNRFDTNIIWDCDGKTKYEQINLCVPPRRENMCIKGLEHLNRTKHSDNKTLLKELQEIASTEGKGISKN FKQMDRENDDG
[0363] ICDAMKYSFADLADIVRGTDNYKNSNGNNNKVEENLKKIFEKIHNINSLKKEYSKDKPDYQRLRSDWWD TNRKEIWKALT
[0364] CSARDNNKIYKKGQKNTNNGKNKCGNEEDPPDDDYIPQPFRWLQEWSEHFCRVQYDNLNKLKEECGECN ENKNGLACMMN
[0365] SNIKDTKCMNCKDACKDYRNMINTWNSQWKKQQEIYKELYNTKNKININKCKVIEFLDKTNDTCHYKHG SAEKFLKESSH
[0366] CTDLTFDKTKNSNNIPYAFENPPDGYKVLCGTTYRKSCKKLKKLGMNYTSENKIDLSGENAKWEKLNDL IYVPPRTQQLC
[0367] LQPLQTLISRTNKTTKVTEYDFSRALQICAYNEANSLHNYYSKYGKDFVFSAGKSQDTKDEIKTHILEN MKRSFADYGNL
[0368] IKGKTQYEYNGLNKKLQDYIKTNLKYNGTDRKTGEDLWNKHKSDIWNSMLVGYNEENPSEPLHDKDIRC KLPDNDSEDEF
[0369] LRWFQEWFEDFCVIKGILIQNVKDACNFNNCRDANNKSIRSCQKPCVKYKTffVEQRKIEYENQIQKYKN LNNNSNEGKES
[0370] LLFLNDKCKGKCECIVQKKSTDNIDKIFEEYPEEYKTQCECQPDPCSDLSITDSGFPDASPFGGGQPRS ACPTRRGNHNN
[0371] CPTEEICKKYDSYINGCRPKTYHDNTNNWDSRGMLNSSSENEGVLIPPRRRHLCTRNIIKNLSRIKNKD HFKDYLMKSAY
[0372] EEGKLLREKYRNNSRDGLNAMMFTFADYADIVKGTDIFGSILSQKLGEITGISNDINERKKWWSEIKNN IWEVMLCSYNR
[0373] TKNNNNFFGNIVRENCNVPNTDEKDQFLRffLLEWGIQACKEKKIRKQALQTKCYCSNPNEISGSDIIKH YPCKSELTKYI
[0374] QWNLMIKELLDQLNIKYQNIKASNNPKNPSEINAEEYIETELKEGECNLVDIERIYNKIKQEHNPLKEI LMYLCPNLEFP
[0375] DDTFEYIGKTETEDTTIEPETPTSDNPEDSIPSISPRDVHPTTGEDTNIFNSNILSSTIPFGIALALSS IAFLFLKKKTL
[0376] SPVDLLRVLDIHKGDYGIPTLKSKNRYIPYRSGTYKGKTYLYVE⑶SDSGHYYEDTTDITSSESEYEEN DINDIYVPGSP
[0377] KYKTLIEVVLEPSKSDGHIPHSAGEPLDDMVGTTIFTDEEWNELKHDFISQYVQRESMGVPQYDVSTEL PMNIGGNVLDD
[0378] GMEEKPFITSIHDRDLYTGEEFSYNINMGTNSMDDPKYVSNNVYSGIDLINDTLSGNQHIDIYDEVLKR KENELFGTNYK
[0379] KNISNNRVAKLTNNDPIMNQLDLLHKWLDRHRDMCNTWNTKEELLDKLNEQWNKDNDAGDIPSDSNKKL NTDVSIQIDMD
[0380] DPKGKKEFSNMDTILDDIEDDIYYDVNDENPFVDDIPMDHNKVDVPKKVHVEMKILNNTSNGSLEPEFP ISDVWNI
[0381] 此外，ITvar60PfEMPl变体由以下核酸序列编码：
[0382] SEQ ID NO :6
[0383] ATGGCACCAAAGGGTAGAAGTACAAATGAAATTGAACTTAGCGCAAGACATGTTTTGGAAAAAATTGGA ATAGGAATATA
[0384] TAATCAGGAAAAAATAAAAAAGAATCCATATGAACAACAATTGAAAGGCACATTATCAAACGCCCGATT TCATGATGGCT
[0385] TGCACAAGGCAGCTGATTTGGGGGTAATACCTGGTCCTTCACATTTTTCTCAGCTTTATTACAAAAAGC ATACTAATAAC
[0386] ACAAAATATTATAAGGATGATAGGCATCCTTGTCATGGTAGACAAGGAAAACGTTTTGATGAAGGTCAA AAATTTGAATG
[0387] TGGTAATGATAAAATAATTGGTAATAGCGATAAATATGGATCCTGTGCTCCACGTAGAAGAAGACATAT ATGTGATCAAA
[0388] ATTTAGAATTCTTAGATAACAATCATACTGATACTATTCATGATGTATTGGGAAATGTGTTGGTCACAG CAAAATATGAA
[0389] GGTGAATCTATTGTTAATGATCATCCAGATAAAAAGAACAATGGTAATAAATCAGGTATATGTACTTCT CTTGCACGAAG
[0390] TTTTGCCGATATAGGTGATATTGTAAGAGGAAGAGATATGTTTAAACCTAATGACAAAGATGCAGTGCG GCATGGTTTAA
[0391] AGGTAGTTTTTAAGAAAATATATGATAAATTGTCACCTAAAGTACAAGAACATTACAAAGATGTTGATG GATCTGGAAAT
[0392] TACTATAAATTAAGGGAAGATTGGTGGACAGCGAACAGAGATCAAGTATGGAAAGCCATAACATATAAA GCTCCACAAGA
[0393] CGCTAATTATTTTAGAAATGTTTCAGGAACAACTATGGCGTTTACAAGTGCAGGAAAATGTAGACACAA TGACAATAGCG
[0394] TCCCAACGAATCTAGATTATGTCCCTCAATTTTTACGTTGGTACGATGAATGGGCAGATGATTTTTGTC GAATAAGAAAT
[0395] CATAAGTTGCAAAAGGTTAAAGACACATGTCAGGGATATAATAATAGTGGTTATAGAATATATTGTAGT GGTGATGGTGA
[0396] GGATTGTACAAATATTCTTAAACAGAATTTTAATATTGTTTCGGATTTTTTTTGTCCGAGCTGTAAAAC CGAATGTACAA
[0397] ATTATAAAAAATGGATAAATAAAAAACAAGGTGAATTTAATAAACAAAAAAAAAAATACGAAAAGGAAA TTAACAATATT
[0398] GCAAGTAATTCTGATAACACATATGATAAAAAAGTTTATAAAACTCTAAAAAGCATGTACCCTTTAGAT ACAAAATTTGT
[0399] AGCAACACTAAAAGAGGCTCCCTTTTGCAATAACAATAATGTAGATGGTATAATAGATTTTAATAAACC AGATGATACAT
[0400] TTTCTAGTTCAACATATTGTGATTCATGTCCTGCATTTGGTGTTATTTGTGAAAATGGTACGTGTACTA AGGTTAATGAA
[0401] GATACATGTAGTAAAATGAATGTTCAGGTTCCAAAAATAATTACAAATAAGGAAGATCCTACTAATATA GGTATTCTTGT
[0402] TAGTGATGACAGAGTAAATGTAATTCCAAATGAATTAGAGAATGTTTGCAAAAATACAGGTATCTTTAA AGGTATTAGAA
[0403] AAGATGAATGGTCATGTAAATATTTATGTAATTTAGATGTCTGTGACCTGAGTCATAATAAAAACAATA CACATATAGAT
[0404] AAACGTATTTCAATTAGAGTACTGTTTAAACGTTGGTTAGAATATTTTTTAAAAGATTATAGTAAATTA AAAAAAAAACT
[0405] GAATTCATGTACAAATAATGGAAAAGAATCCATATGTATAAATGAATGTAAAAAAAAATGTGAATGTGT GGGAAAATGGG
[0406] CAGAAGAGAAAAGAAAAGAATGGGAAAAAGTAAGAAAGCGTTTCTTTAATCAATATAATGTTGATGATT CACTAAAATCT
[0407] TACGAAGTGAAAACATTTGTAAATGGAAATGTAGATCGTAGTGATATTAAGAATGCATTAAATGAGGGT GAAAATTTAGA
[0408] AGCGTTGCAAGATTCTGATGAATGTATTAAACCTCATAATTCCAAGAAAGACACATGTGTAAAAAATGA CGTCGTAAATA
[0409] TTTTAATTAATAGACTTAAAAAAAAAATTGATGATTGTAAATCCAACATGATAATAGAACTAATCAAAT TTGTTGTGAT
[0410] GAGTTACCTGAAAGTAAAGAAGATAATGAAGATGAAGAGGAAGAAGGGGAAAAGAAAAAAAATTCAAAA CATTTGGAGGA
[0411] GACTAAAGAGAAAAAAGAACTGGATGACAACAATTTTTTGGATTTGTGCAACAATGTGAAGAAATATAT TGAGGATAATA
[0412] ATAAGCAAATAAGTATACAACATAAATGCAATACGAAAGGAGATGGAAATTGGAATGATAGTACAAAAA AGATCGATATT
[0413] CAACATACTGGAGCTCATATGCCACCAAGAAGAAAATCATTATGTATTCGTGAGTTACGATATTTGGTA GAAATTGGAGG
[0414] AGATAAAAACATAGATGATTATAAAAATGCGTTTACTAAATGTGCATCAATAGAAACATATTTGTTATG GCAAAAATACA
[0415] AAAAATCTAATAGATCAGAAGAAGATAAATTAAAAGGTGGAGGGATTCCAGAAGATTTTAGAGGAATAA TGTATTATACA
[0416] TTTGGTGATTACAGAGATATATTTTTGGGAACAGATATTTCTTCAGATGGTAATATTAAAAATATATCA AATAAAATAAA
[0417] AGATTTAATGAAAGAAAAGTATAGTAAAGCAACAGGTCATAAAGGAGAAAACCATAATTCAAATCTTCA ATCTTCGTGGG
[0418] ATGAACATAAAAGGACCATATGGAAAGGAATGTTATGTGGATTAACCTATGGTATATCAAATGAACAAC AAAAAAAAAAT
[0419] ATTCGCAAAATGCTCAACAACAAGTACAAATACCCATGCGATCTAGAAACATTTTCAAAGAAACCACAA TTTCTTCGTTG
[0420] GTTTAACGAATGGAGTGAAGATTTTTGTAAAAATTACAAAAATGCTATTGATATATTAAAAAAGGATTG TACAGAAGCAG
[0421] ATTGTATGAATAAATTAGTAAATAATCGTGAAAAAACAAGAAATGTAAAGAAGCGTGTGAACATTTTAA AGAGTGGATA
[0422] AAAGGATGGAAAAATCAATATGAACAACAAAGAAAAAAATTTAATATTGATAAAAATGTTGAACAAAAG GAGACAGCATA
[0423] TATAAACGTAAATGGTCTGGAACCCTATGAATTTTTTCAAAACCAATATTTTGTGGGAAACATGTGAAT GCATGAAAAATA
[0424] AATCAGAGTCATCTGCAAATAATGATGAAAATATACCAGAAGCATTCGATGAAAAACCAAAGAGTTCAA GGACAAATGT
[0425] CCATGTACTTATGATATACCTGAACCTAGCGAAACTATGAGTTGTATAGAGAAAGCTGCCTTCAAATTA CGTTATGCTTC
[0426] TGAAGATAAAATTCATAGTAAAATTAGTAGTAAATTGAAAGGAAACGGTTCAGCGTTTTCATGTACGAA CAGCGCAAGTG
[0427] ACAATATTTTTGATGAGACAAGTTGTTATAAGAATGAATTTAACAAAACAGAAAATATTAATTCAGTGA AAGCTTCAAAC
[0428] ATGAATCGTTTTGATACAAATATTATATGGGATTGTGATGGAAAAACAAAATATGAGCAAATTAATTTA TGTGTTCCGCC
[0429] TAGAAGAGAAAATATGTGTATAAAGGGGCTAGAACACTTGAACGAAACTAAACATTCTGATAATAAAAC GCTATTAAAAG
[0430] AGCTTCAAGAAATTGCAAGTACTGAAGGGAAAGGCATATCAAAAAATTTTAAACAAATGGATAGAGAAA ATGATGACGGA
[0431] ATATGTGAtGCCATGAAGTACAGTTTTGCCGATTTGGCAGATATAGTAAGAGGTACAGATAATTACAAA AATTCTAATGG
[0432] TAATAATAATAAAGTAGAGGAAAACCTTAAAAAAATTTTCGAAAAAATACACAATATTAATAGTCTTAA AAAAGAATATA
[0433] GTAAGGACAAACCGGATTATCAAAGATTACGATCTGACTGCTGCGATACGAATAGAAAAGAAATATGGA AAGCATTAACG
[0434] TGTTCAGCAAGGGATAATAATAAAATATACAAGAAAGGGCAAAAAAATACTAATAATGGAAAGAATAAA TGTGGAAATGA
[0435] AGAGGATCCTCCTGATGATGATTATATTCCACAACCTTTTCGTTGGTTACAAGAATGGAGTGAACATTT TTGTAGAGTTC
[0436] AATATGATAATCTGAATAAACTGAAAGAAGAATGTGGAGAATGTAATGAAAATAAAAATGGTTTAGCTT GTATGATGAAT
[0437] TCAAATATTAAAGATACAAAATGTATGAATTGCAAAGATGCATGCAAGGACTACAGAAATATGATTAAC ACATGGAATAG
[0438] TCAATGGAAAAAACAACAAGAAATATATAAAGAATTATATAATACTAAAAATAAAATAAATATtAATAA ATGTAAGGTGA
[0439] TAGAATTTTTAGATAAAACAAATGATACGTGTCACTATAAACCAGGAAGTGCAGAAAAGTTTCTTAAAG AATCTAGTCAT
[0440] TGTACTGACCTTACATTCGACAAAACAAAGAATTCAAAtAATATTCCTTATGCCTTTGAAAATCCACCT GATGGATATAA
[0441] AGTTTTATGTGGTACAACATATAGAAAATCAtGTAAAAAGCTAAAAAAATTAGGGATGAATTATACGTC AGAAAACAAAA
[0442] TTGATTTAAGTGGAGAAAACGCTAAGTGGGAAAAACTTAATGATTTGATATATGTCCCTCCACGAACAC AACAATTATGT
[0443] TTACAACCTTTGCAAACGTTGATATCACGTACCAATAAAACCACGAAAGTAACAGAATATGATTTCTCC AGAGCATTACA
[0444] AATATGTGCATATAATGAAGCAAATTCTCTTCACAATTATTATAGTAAGTATGGCAAAGATTTTGTATT TAGTGCTGGTA
[0445] AGTCTCAAGATACTAAAGATGAAATAAACACACATTCTTGAAAATATGAAAAGAAGCTTTGCTGATTAT GGTAATTTA
[0446] ATTAAAGGAAAGACCCAATACGAATATAATGGTTTAAACAAAAAGCTTCAGGATTACATAAAGACTAAT TTAAAATATAA
[0447] TGGAACTGACAGAAAAACAGGTGAAGATCTTTGGAATAAACATAAATCCGATATTTGGAATTCTATGCT ATGTGGATATA
[0448] ATGAAGAAAACCCAAGTGAACCACTTCATGATAAAGACATAAGATGTAAATTACCTGATAATGATAGTG AAGATGAATTT
[0449] TTACGTTGGTTTCAAGAATGGAGAGAAGATTTTTGTGTTATCAAAGGTATACTGATACAAAATGTGAAA GATGCATGTAA
[0450] TTTTAATAATTGTGAAGATGCAAATAATAAATCCATAAGATCTTGTCAAAAACCATGTGTCAAATACAA AACATGGGTTG
[0451] AACAAAGAAAAATTGAATACGAAAATCAAATCCAGAAATATAAAAATCTCAACAATAATTCAAATGAAG GAAAAGAATCA
[0452] CTTTTATTTTTAAACGATAAATGTAAAGGGAAATGTGAATGTATAGTTCAAAAAAAAAGTACTGATAAT ATCGATAAGAT
[0453] TTTTGAGGAATATCCTGAAGAATACAAAACGCAATGTGAATGTCAGCCTGATCCATGTAGTGACCTAAG TATTACAGATA
[0454] GTGGATTTCCTGATGCAAGTCCTTTTGGTGGAGGTCAACCACGTTCCGCGTGTCCTACAAGGCGAGGAA ATCATAATAAT
[0455] TGCCCTACTGAAGAAATATGTAAAAAATATGATAGCTATATTAATGGTTGTCGCCCTAAAACATATCAC GACAATACAAA
[0456] TAATTGGGATAGCAGAGGCATGCTAAACAGTTCATCTGAAAATGAAGGTGTATTAATTCCTCCTAGAAG GCGACATTTAT
[0457] GCACAAGAAATATAATTAAAAATTTGTCACGTATTAAAAATAAAGATCATTTTAAAGATTACCTAATGA AATCTGCTTAT
[0458] GAAGAAGGAAAACTTTTAAGGGAAAAATATAGAAATAATAGTAGAGATGGATTAAATGCAATGATGTTC ACTTTTGCTGA
[0459] TTATGCAGATATAGTTAAAGGTACTGATATATTTGGCAGTATATTATCTCAAAAATTAGGTGAAATAAC TGGAATAAGCA
[0460] ATGATATAAATGAGCGTAAAAAATGGTGGAGTGAAATTAAAAATAATATATGGGAAGTTATGTTGTGTT CTTATAATAGA
[0461] ACAAAGAATAATAATAATTTTTTCGGAAACATTGTGAGAGAAAACTGTAATGTTCCTAACACAGATGAA AAGGACCAATT
[0462] TTTGAGATGGTTACTTGAATGGGGTATACAAGCATGTAAAGAAAAAAAAATCAGAAAACAAGCCCTTCA AACGAAGTGTT
[0463] ACTGTTCAAACCCAAACGAAATATCGGGTTCCGATATTATAAAACATTACCCTTGTAAAAGTGAACTCA CCAAATATATA
[0464] CAATGGAATTTAATGATTAAAGAATTATTAGATCAATTAAATATAAAATATCAAAATATAAAAGCATCT AATAATCCGAA
[0465] AAATCCCTCGGAAATAAATGCAGAGGAATACATAGAAACAGAACTTAAGGAAGGTGAATGTAATTTGGT TGATATAGAAC
[0466] GAATATATAATAAAATTAAACAAGAACATAATCCATTAAAAGAAATATTAATGTATTTATGTCCTAATT TAGAATTTCCT
[0467] GATGATACATTCGAATACATTGGGAAAACCGAAACTGAAGATACAACTATTGAACCAGAAACCCCTACA TCCGATAACcC
[0468] TGAGGATAGTATTCCTTCCATTTCACCTGAAGACGTTCACCCAACAACAGGAGAAGACACAAACATTTT CAACAGTAACA
[0469] TATTATCATCTACTATCCCTTTTGGAATTGCTTTGGCCTTAAGTTCGATCGCTTTCCTGTTCCTGAAGa
[0470] tcccctgtggacctcttacgtgtacttgatatccataaaggcgattatggaatacctacactgaaatcc aaaaataggta
[0471] tataccatatagaagtggtacatataaaggcaaaacatatttatatgttgaaggagatagtgatagtgg acactactacg
[0472] aagatacaactgatattacttcatccgaaagtgaatatgaagaaatggatatcaatgatatatatgtac caggtagtcct
[0473] aaatataaaacattgatagaagtagtactggaaccatccaaaagtgatggtcatataccacatagtgct ggtgaaccact
[0474] agatgatatggtaggtaccactatatttacagatgaggaatggaatgaactgaaacacgattttatatc acaatatgtgc
[0475] aacgtgaatcaatgggtgtaccacaatatgatgtatcaaccgagttaccaatgaatataggaggtaatg ttttagatgat
[0476] ggcatggaagaaaaaccttttattacttctattcatgatagggatttatatactggagaagaatttagt
[0477] tatgggtactaatagtatggatgatccaaaatatgtatcaaataatgtatattctggtatcgatttaat taatgacacat
[0478] taagtggtaatcaacatattgatatatatgatgaagtattgaaaagaaaagaaaatgaattatttggga caaattataag
[0479] aaaaatatatcgaataaccgtgtagctaaattaacaaataatgatccaattatgaaccaattagatttg ttacataaatg
[0480] gttagatagacatagagatatgtgcaatacgtggaataccaaggaagaattattagataaattgaatga acaatggaata
[0481] aagataatgatgctggtgatataccaagtgatagtaacaaaaagttgaatacggatgtttcgatacaaa tagatatggat
[0482] gatcctaaaggaaagaaggaatttagtaatatggatactatcttggatgatatagaagatgatatatat tatgatgtaaa
[0483] tgatgaaaacccatttgtggatgatatacctatggatcataataaagtagatgtaccaaagaaagtaca tgttgaaatga
[0484] aaatccttaataatacatccaatggatccttggaaccagaatttcctatatcggatgtatggaatatat aa
[0485] 据此，本发明触及由以上述SEQ ID N0S1，2，3，4，5或6给出的序列编码或具有 以上述SEQ ID N0S1，2，3，4，5或6给出的序列的PfEMPl抗原。手艺东说念主员将和洽由娇傲与 本文提供的序列一定进度的同源性或并吞性的序列编码的PfEMPl抗原也在本发明的范围 内。尤其，由与 SEQ ID N0S ;1，2， 3， 4， 5 或6 中任一个娇傲至少 40% ，45% ，50% ，55% ，60 %，65%，70%，75%，80%，90%，91%，92%，93%，94%，095%，96%，97%，98%或99% 同源 性/并吞性的序列编码的PfEMPl抗原被以为是本发明中具有潜在实用性的PfEMPl抗原。 本发明进一步触及重组或合成产生的由与以SEQ ID N0S:1，2，3，4，5或6给出的那些具有 同源性和/或并吞性的序列编码的或具有与以SEQ ID勵5:1在线av 啪啪啦，2，3，4，5或6给出的那些具 有同源性和/或并吞性的序列的PfEMPl抗原。
[0486] 在扫数情况下在线av 啪啪啦，本发明包括PfEMPl抗原，所述PfEMPl抗原与由以SEQ ID NOS: 1，2， 3， 4， 5或6给出的序列编码的或具有以SEQ ID NOS: 1，2， 3， 4， 5或6给出的序列的 那些比较，包含（i) 一种或多种突变-表征为氨基酸/核酸缺失，添加，取代和/或插入 的突变和（ii)对于SEQ ID N0S:2， 4和/或6的一种或多种保守氨基酸取代-术语"保守 取代"包括以具有类似性质的并基本不转换自然（或野生型）卵白的物理化学性质和/或 结构或功能的替代氨基酸取代卵白或肽的一种或多种氨基酸的步履。自然，手艺东说念主员将理 解遗传密码子的简并性允许密码子中的一种或多种碱基的取代而不转换一级氨基酸序列。 因此，尽管SEQ ID N0S:1，3和5编码特定PfEMPl抗原，但是密码子的兼并性不错用于获 得编码相并吞级氨基酸序列的变体核酸序列。
[0487] 手艺东说念主员将和洽不错使用抒发载体和/或系统重组坐蓐本文形容的PfEMPl抗原。 在这方面，本发明提供载体，例如包含编码本发明的PfEMPl抗原的核酸序列的细菌抒发 载体（例如PET或pGEX系统载体）。手艺东说念主员将和洽编码本发明的PfEMPl抗原的核酸序 列不错被密码子优化以保证在特定抒发系统中的最大抒发。本发明进一步提供升沉有本发 明的载体的宿主细胞（例如细菌细胞（大肠杆菌））。
[0488] 在其它实践决策中，本发明提供用于产生东说念主中的免疫应酬的药物-所述药物包 括选开脱HB3var6 ;TM284varl ;和ITvar60组成的组的一个或多个PfEMPl抗原（或其一个 或多个片断）。此外，本发明提供产生东说念主中的免疫应酬的方法，所述方法包括向东说念主受试者施 用免疫原性量的一种或多种PfEMPl抗原（或其片断），所述PfEMPl抗原选开脱HB3var6 ; TM284varl ;和 ITvar60 组成的组。
[0489] 手艺东说念主员将和洽术语"片断"包括本文形容的PfEMPl抗原的免疫原性和/或抗原 性片断-包括由SEQ ID N0S1，2， 3， 4， 5或6编码的那些。在一个实践决策中，片断不错 包含PfEMPl抗原的齐全结构域或区域-包括例如，一种或多种Duffy勾搭样（DBL)结构 域。在其它实践决策中，合适的片断不错包含介于约10和n-1个氨基酸-其中"η"是 齐全 PfEMPl 抗原的氨基酸总和（HB3var6:n = 3424 ;TM284varl:n = 2790 ;ITvar60:n = 2716)。通过例如的面孔，PfEMPl抗原性片断不错包含约10， 20， 50， 100， 200， 300， 400， 500， 600， 700， 800， 900， 1000， 1100， 1200， 1300， 1400， 1500， 1600， 1700， 1800， 1900， 2000， 2100， 2 200， 2300， 2400， 2500， 2700， 2800， 2900， 3000， 3100， 3200， 3300 或 3400(相邻的）PfEMPl 氨 基酸或由约 10， 20， 50， 100， 200， 300， 400， 500， 600， 700， 800， 900， 1000， 1100， 1200， 1300， 14 00， 1500， 1600， 1700， 1800， 1900， 2000， 2100， 2200， 2300， 2400， 2500， 2700， 2800， 2900， 3000 ，3100， 3200， 3300或3400(相邻的）PfEMPl氨基酸组成。在其它实践决策中，适于用于本 发明的PfEMPl抗原性片断不错包含大概产生交叉反映性/保护性免疫应酬的至少一种表 位。
[0490] 除了矍铄适于产生东说念主中交叉反映性和/或保护性免疫应酬的PfEMPl抗原外，本 发明东说念主一经进一步矍铄也适于产生东说念主中交叉反映性和/或保护性免疫应酬的PfEMPl抗原 的特定片断，
海量激情文学区域和/或结构域。
[0491] 因此，在第四个方面，本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜蛋 白-1 (PfEMPl)的Duffy勾搭样（DBL)结构域，其用于产生东说念主中的免疫应酬。
[0492] 在第五个方面，本发明提供一种或多种恶性疟原虫红细胞膜卵白-1 (PfEMPl)的 Duffy勾搭样（DBL)结构域用于制备用于产生东说念主中的免疫应酬的药物的用途。
[0493] 在第六个方面，本发明提供产生东说念主中的免疫应酬的方法，所述方法包括向东说念主受试 者施用一定量的恶性疟原虫红细胞膜卵白-1 (PfEMPl)的一种或多种Duffy勾搭样（DBL) 结构域的方法。
[0494] 如本发明的第一，第二和/或第三个方面中使用的PfEMPl抗原所具有的，第四， 第五和第六个方面使用的DBL结构域适于产生交叉反映性和/或保护性免疫应酬/抗体。 也便是说，由本发明提供的针对PfEMPIDBL结构域产生的免疫应酬不错包含对许多不同恶 性疟原虫株的PfEMPl抗原娇傲一定进度的特异性，遴荐性和/或亲和力的抗体。
[0495] 在一个实践决策中，用于本发明的第四，第五和/或第六个方面的DBL结构域是 选开脱以下组成的组中的一种或多种：
[0496] (i)NTS-DBLl α 结构域；
[0497] (ii)DBL4 ε 结构域；和
[0498] (iii)⑴和/或（ii)的（免疫原性/抗原性）片断。
[0499] 在一个实践决策中，本发明的第四，第五和/或第六个方面的NTS-DBLla结构域 源自PfEMPl变体HB3var6，TM284varl和/或ITvar60。在一个实践决策中，用于本发明的 第四，第五和/或第六个方面的NTS-DBL1 α结构域源自HB3var6，和/或TM284var 1。
[0500] 在其它实践决策中，DBL4 ε结构域获自PfEMPl变体ITvar60。
[0501] 鉴于上述情况，本发明提供包含选开脱以下组成的组的一种或多种PfEMPIDBL结 构域的用于用途的抗原，用途和方法：
[0502] (i)PfEMPl 变体 HB3var6 的 NTS-DBL1 α 结构域；
[0503] (ii)PfEMPl 变体 TM284varl 的 NTS-DBL1 α 结构域；
[0504] (iii)PfEMPl 变体 ITvar60 的 DBL4 ε 结构域；和
[0505] (iv)上述（i)-(iii)中任一个的（免疫原性/抗原性）片断。
[0506] 应该和洽，扫数对DBL结构域的援用包括DBL结构域片断。如上文界说的，用于 本发明的DBL片断不错是免疫原性的和/或抗原性的，而且因此大概产生东说念主中保护性/交 叉反映性免疫应酬。换句话说，DBL片断不错大概产生（raising)(或产生（generating)) 与当宿主被施用齐全DBL抗原时产生的免疫应酬基本上类似或通常的宿主免疫应酬。适于 使用的DBL结构域片断不错包括包含齐全DBL序列的10， 20， 30， 40或50个（优选相邻的） 氨基酸或由齐全DBL序列的10， 20， 30， 40或50个（优选相邻的）氨基酸组成的那些。在 一个实践决策中所述片断不错包含从约10个氨基酸到约n-1个氨基酸的随便数目的DBL 结构域氨基酸或由从约10个氨基酸到约n-1个氨基酸的随便数目的DBL结构域氨基酸组 成，其中η是关连DBL结构域的氨基酸总和。
[0507] 为了通俗起见，本说明书中形容的不同PfEMPl抗原，其突变体/变体，片断和结 构域应该共同被称为"PfEMPl抗原"。具体来说，以下被视为证据本发明的PfEMPl抗原：
[0508] (i) PfEMPl (包括如上文界说的突变体或其序列变体）；
[0509] (ii)勾搭IgM的形成玫瑰花结的PfEMPl ;
[0510] (iii)PfEMPl 变体 HB3var6 ;
[0511] (iv) PfEMPl 变体 TM284varl ;
[0512] (v) PfEMPl 变体 ITvar60 ;
[0513] (vi) PfEMPIDBL 结构域；
[0514] (vii)NTS-DBLl α 结构域；
[0515] (viii)DBL4 ε 结构域；
[0516] (ix)PfEMPl 变体 HB3var6 的 NTS-DBL1 α 结构域；
[0517] (x)PfEMPl 变体 TM284varl 的 NTS-DBL1 α 结构域；
[0518] (xi)PfEMPl 变体 ITvar60 的 DBL4 ε 结构域；和
[0519] (X) (i)-(ix)中任一个的（免疫原性/抗原性）片断。
[0520] 手艺东说念主员将和洽，PfEMPl抗原，片断和/或结构域不错找到非常的愚弄，如用于 产生免疫应酬的疫苗。自然对疟疾的免疫性不错自然形成，但需要对疟疾寄生虫（例如， 恶性疟原虫）的重复露馅。骨子上，不但愿受表面戒指，本发明部分基于以下发现：在从重 症（脑）疟疾中收复的儿童中检测到针对PfEMPl抗原的抗体-此外本发明东说念主扎眼到这些 抗体对本文形容的特定PfEMPl抗原（即PfEMPl变体，HB3var6 ;TM284varl和ITvar60)显 示一定进度的特异性。因此，PfEMPl变体HB3var6 ;TM284varl和ITvar60不错代表典型的 疫苗候选物。
[0521] 自然，来自宇宙上疟疾不是问题的区域（例如欧洲）的年青东说念主和东说念主中，自然免疫 的水平低，因为存在对疟原虫的露馅不及。此外，在对疟原虫属（例如恶性疟原虫）的低免 疫性/无免疫性的东说念主中，感染不错变成重症疟疾。才略域手艺东说念主员将和洽，重症疟疾的情 况不错导致继发性并发症，包括升天，晕厥（脑疟疾），呼吸可贵，低血糖和严重贫血。因 此，时时时露馅于疟疾寄生虫的儿童和/或搭客易于发展疟疾和/或重症疟疾。
[0522] 由本发明提供的疫苗不错用于产生儿童中免疫应酬，其中所述免疫应酬针对疟 疾和重症疟疾的发展赐与保护。在其它实践决策中，本发明提供不错用于在很少露馅于疟 疾或未始露馅于疟疾的东说念主（这不错包括，例如来自宇宙上不存在疟疾的那些区域的搭客） 中产生免疫应酬的疫苗。同上，通过使用本发明提供的疫苗产生的免疫应酬不错针对疟疾 和重症疟疾的发展提供保护。
[0523] 在第七个方面，本发明提供算作组合物的本发明的PfEMPl抗原，所述组合物包含 药学上可接受的稀释剂，载体和/或赋形剂。在一个实践决策中，本发明的组合物不错是 无菌的。
[0524] 不错配制或制备组合物用于肠胃外施用-包括，例如通过皮下，皮内，肌肉内和 /或静脉内打针。在一个实践决策中，本发明的组合物不错包含证据已知的工艺使用合适的 散布、润湿和/或悬浮剂配制的含水的或含油的悬液。在这方面，手艺东说念主员将和洽可接受 的载体，稀释剂和/或赋形剂不错包含1，3_ 丁二醇，水，林格溶液，和等渗氯化钠溶液。 此外，成例使用无菌的，不蒸发性油算作溶剂或悬浮介质。为了该主义，不错使用任何和善 的不蒸发性油，包括合成的单酸甘油脂或甘油二酯。此外，脂肪酸（如油酸）用于制备根 据本发明的可打针组合物。
[0525] 在一个实践决策中，由本发明提供的组合物和疫苗不错进一步包含一种或多种 佐剂。手艺东说念主员将和洽术语"佐剂"不错包括任何增强或促进免疫的宿主对疫苗或免疫原 性组合物的抗原的免疫应酬的试剂。合适的佐剂不错包括明矾和/或弗氏佐剂。
[0526] 由本发明提供的组合物和/或疫苗不错通过单个或多个剂量的灵验量施用。优选 将两个或更多个剂量施用预定的时期。
[0527] 通过例如的面孔，不错在施用开动疫苗剂量（初度免疫）之后，在初度免疫后的 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9和/或10周斥逐赐与一次或更屡次加强剂量（二次免疫）。
[0528] 本发明计划了其它施用模式而且包括鼻内，腹膜内，鞘内，直肠，输注和肺内施 用。施用还不错通过滴鼻剂，气溶胶，通过皮肤或膜名义的输注或摄取。
[0529] 在第八个方面，本发明提供包含PfEMPl抗原的疫苗，其用于颐养或谢绝疟疾或 重症疟疾。在一个实践决策中，本发明的疫苗不错谢绝，戒指或遏制重症疟疾的发展。技 术东说念主员将和洽不错谢绝地施用疫苗以在易感群体中谢绝疟疾或重症疟疾的发展。易感东说念主群 不错包含儿童或青少年和/或不成例，往往露馅于疟疾寄生虫的那些（例如欧洲游客）。
[0530] 在第九个方面，本发明提供包含PfEMPl抗原的疫苗在制备用于颐养或谢绝疟疾 和/或重症疟疾的药物中的用途。
[0531] 由本发明提供的PfEMPl抗原不错与其它抗原，例如其它疟原虫（恶性疟原虫） 抗原和/或其它细菌或病毒抗原组合以得回组合疫苗以使用。
[0532] 在第十个方面，本发明提供颐养或谢绝疟疾/重症疟疾的方法，所述方法包括向 东说念主受试者施用疫苗，所述疫苗包含免疫原性量的PfEMPl抗原。
[0533] 在第十一个方面，本发明提供本文形容的一种或多种PfEMPl抗原，其用于会诊 或检测东说念主受试者-尤其儿童（即年青东说念主或青少年东说念主受试者）中的疟疾和/或重症疟疾。 由本发明第十一个方面提供的会诊进程不错包括检测由被怀疑患有疟疾/重症疟疾，或被 疟原虫（例如恶性疟原虫）感染的受试者提供的样品中PfEMPl抗原水平的方法。手艺东说念主 员将和洽不错通过以下面孔检测PfEMPl抗原的水平：免疫学手艺，如ELISA(使用对预定 的PfEMPl抗原娇傲亲和力，特异性和/或遴荐性的抗体），免疫萍踪，SDSPAGE和/或基 于PCR的手艺（其探伤样品的恶性疟原虫核酸-尤其，编码PfEMPl抗原的那些序列的水 平）。
[0534] 在第十二个方面，本发明提供对本文形容的PfEMPl抗原中的一种或多种娇傲一 定进度的亲和力，特异性和/或遴荐性的抗体。不但愿受表面戒指，松懈玫瑰花结的侵扰 不错是对重症疟疾的有价值的扶植颐养。通过例如的面孔，对本文形容的PfEMPl抗原中 的一种或多种娇傲亲和力，特异性和/或遴荐性的抗体，不错用于畅通微血管中阻拦的血 流（其是由形成玫瑰花结的寄生虫引起的主要病理事件）。此种类型的"松懈玫瑰花结"干 预不错类似于卒中庸腹黑病发作后使用的松懈凝块的药物，以移除由形成玫瑰花结的细 胞引起的对微血管血流的梗阻，并收复正常组织氧合。
[0535] 术语"抗体"包括多克隆抗体以及单克隆抗体并包括勾搭抗原和/或表位的抗体 片断，比如，例如，Fab， Fab2， scFv， VH结构域和/或结构域片断。对卵白/肽序列特异的 多克隆/单克隆抗体的坐蓐和分离是才略域中成例的，而且进一步信息不错在例如"Basic methods in Antibody production and characterisation^oward&Bethell， 2000， Taylor &Francis Ltd中找到。本文形容的抗体不错缀合于可检测部分，比如，例如，化学发光和 /或荧光部分。本文形容的抗体不错用于会诊进程，例如，检测样品中恶性疟原虫，或诊 断东说念主中疟疾或重症疟疾（如由恶性疟原虫引起的）。任何会诊进程不错包括将由东说念主受试者 提供的样品与本发明的抗体搏斗-检测到勾搭于PfEMPl抗原的抗体默示样品由感染有恶 性疟原虫寄生虫的东说念主提供。术语"样品"不错指由东说念主受试者提供的任何生物材料和/或流 体而且不错包括，例如，血液，血清，血浆，汗液，唾液和/或组织活检的样品或细胞样 品。
[0536] 由本发明提供的抗体不错进一步用于被迫免疫决策以颐养或谢绝疟疾和/或重 症疟疾。因此，本发明的一个实践决策提供证据本发明的第十二个方面的一种或多种抗 体，其用于颐养和/或谢绝痕疾/重症痕疾。
[0537] 因此，本发明的第十三个方面提供对本文形容的PfEMPl抗原娇傲特异性，遴荐 性和/或亲和力的抗体，其用于颐养或谢绝疟疾和/或重症疟疾。本发明进一步提供对 PfEMPl抗原娇傲特异性，遴荐性和/或亲和力的抗体在制备用于颐养或谢绝疟疾的药物中 的用途。在更进一步的方面，本发明提供颐养或谢绝疟疾的方法，所述方法包括向需要其 的东说念主受试者施用颐养灵验量的对PfEMPl抗原娇傲特异性，遴荐性和/或亲和力的抗体。
[0538] 在第十四个方面，本发明提供大概识别PfEMPl和未感染的红细胞间互相作用的 一种或多种化合物，其用于颐养和/或谢绝疟疾/重症疟疾。通过例如的面孔，所述化合 物不错包含小分子（例如卵白/肽，核酸碳水化合物，有机/无机分子）或对由本发明提 供的PfEMPl抗原，片断，表位和/或结构域中的一种或多种娇傲亲和力，遴荐性和/或 特异性的抗体。此外，本发明不错延迟至提供小分子，所述小分子不错用在用于颐养或预 防玫瑰花结形成的方法和药物中。
[0539] 详实形容
[0540] 咫尺将参考下图详实描模本发明，所述图娇傲：
[0541] 图1:恶性疟原虫形成玫瑰花结的寄生虫的舛错名义抗原（类型APfEMPl变体） 的矍铄和用于免疫的重组卵白的坐蓐。a)来自恶性疟原虫形成玫瑰花结的实验室株的显耀 抒发的变体的PfEMPl结构域结构。娇傲先前形容的形成玫瑰花结的变体ITvar9 [12， 20] 用于比较。结构域类型基于保守基序[6，45]。NTS:N-结尾部分；DBL:Duffy勾搭样；CIDR: 富半胱氨酸结构域间（InterDomain)区域；ATS:酸性结尾部分；TM:跨膜区域。*IT分离株 领先来自巴西，然则在20世纪80年代初期的交叉浑浊之后，咫尺的IT/FCR3株被以为是 源自东南亚的[65]。b)来自同基因型的形成玫瑰花结的（R+)和不形成玫瑰花结的（R-) 寄生虫的RNA的RNA图章，其用对于各个株的来自玫瑰花结-特异性变体的PfEMPl结构域 (R+DBL探针，高严格度）和用外显子II探针（中等严格度）（其检测扫数var基因）探伤 [44]。箭头指令主要的玫瑰花结-特异性变体。通过用溴化乙锭（Et Br)染色说明R+和 R-RNA的格外上样量。c)在大肠杆菌中坐蓐重组NTS-DBLa结构域以免疫兔。l:TM180var l，2:Muzl2varl，3:TM284varl，4:ITvar60，5:HB3var6。Μ:分子量符号；R:还原的；NR:非还 原的。
[0542] 图2:针对PfEMPl的抗体识别活的感染的红细胞名义，而且娇傲恶性疟原虫形成 玫瑰花结的实验室株之间的交叉反映性。a)用针对ITvar60的抗体（25μ g/ml)就同源寄 生虫（IT/PAR+)测试的免疫荧光测定（IFA)。左图：娇傲感染的红细胞位置的DAPI染色。 右图：活的感染的红细胞名义上的点状荧光。b)娇傲与难免疫的兔IgG对照比较，ITvar60 的抗体针对IT/PAR+寄生虫的滴定的流式细胞术。滴定至极（end titre)(这里界说为通 过IFA/流式细胞术，感染的红细胞中多于50%是阳性的最低浓度）为0. 1 μ g/ml。c)针对 如标明的具有各样不同粘附表型的恶性疟原虫实验室株测试PfEMPl抗体（从400 μ g/ml 动手总IgG的四倍稀释）。各个抗体：寄生虫组合的滴定至极（如上文界说的）在每个矩 形内娇傲。同源抗体：寄生虫组合以粗体标出。阴性对照是难免疫的兔IgG，和针对来自 不形成玫瑰花结的类型A PfEMPl变体（HB3var3，由遴荐用于勾搭东说念主脑内皮细胞的不形成 玫瑰花结的寄生虫HB3-HBEC抒发）的NTS-DBLa的抗体。*The HB3R+寄生虫包含不同于 抒发HB3var6的细胞的抒发HB3var3的感染的红细胞的亚群，表S1)。
[0543] 图3:针对PfEMPl的抗体在恶性疟原虫形成玫瑰花结的实验室株中玫瑰花结抑 制和调换并吞作用中娇傲交叉反映性。a)玫瑰花结遏制测定以细则PfEMPl抗体对同源和 异源的形成玫瑰花结的实验室株的剂量依赖型成果。将数据与无加入的抗体，在玫瑰花 结中包含感染的至少40%的红细胞的对照比较较。娇傲一式三份的值的平均和轨范偏差。 IC50:产生50%玫瑰花结遏制的抗体浓度。b)除由0. lmg/ml的各个抗体（针对HB3var6 ，TM284varl， ITvar60， Muzl2varl， TM180varl 和 ITvar9)的羼杂物组成的抗-Ros 汇聚体之 夕卜，用lmg/ml的抗体的如上文的玫瑰花结遏制测定。对照为如对于图2c的。c)与单核细 胞系Thp-Ι共孵育的爱护的IT/PAR+感染的红细胞的并吞作用测定[12]。数据娇傲为以兔 抗-东说念主红细胞抗体爱护的阳性对照的百分数。
[0544] 图4:针对PfEMPl的抗体在恶性疟原虫临床分离株的名义识别和玫瑰花结遏制中 娇傲交叉反映性。a)以0. 4mg/ml的来自难免疫的兔的总IgG(阴性对照，左图）和针对 TM284varl的抗体（中图）的临床分离株MAL43的流式细胞术。以Hoescht染色的感染的 红细胞在右半部分，而且以Alexa Fluor488染色的抗体-阳性的感染的红细胞在右上象 限。直方图的访佛（右图）娇傲染色的感染的红细胞的明确群体。b)以PfEMPl抗体测试 崭新临床分离株名义反映性（以〇.4mg/ml的IFA和流式细胞术）和玫瑰花结遏制（lmg/ ml)。玫瑰花结遏制百分数娇傲于对于扫数分离株：抗体组合的每个矩形中，具有>25% 的玫瑰花结遏制。对照为如对于图2c的，而且抗-Ros汇聚体为如对于图3b的。仅测试 抗-Ros汇聚体的玫瑰花结遏制。c)对于五种临床分离株的娇傲阴性对照，抗-PfEMPl阳 性和IgM-阳性的感染的红细胞的流式细胞术直方图。仅通过IFA测试其它分离株。"阴性 PfEMPlAb"为针对TM180varl的抗体而且IgM阴性对照为小鼠 IgGl同种型对照。
[0545] 图5:交叉反映性PfEMPl抗体不识别东说念主IgM。a)用于识别东说念主IgM的ELISA。阳性 对照为抗-东说念主IgM抗体。娇傲来自一式三份的孔的光密度（0D)值的平均值和SD。b)在有 和无东说念主IgM的情况下滋长的而且以抗-TM284varl抗体染色的IT/PAR+寄生虫的流式细胞 术。
[0546] 图6:对IgM的遴荐得回与PfEMPl抗体交叉反映的形成玫瑰花结的感染的红细 胞。a)用抗-东说念主IgM包被的Dynabeads遴荐妥当培养的肯尼亚分离株9197三次。通过流 式细胞术比较未遴荐的和遴荐的系娇傲：IgM_遴荐的寄生虫被针对HB3var6的交叉反映性 PfEMPl抗体识别。b)双染（检测PfEMPl抗体的AlexaFluor488抗-兔IgG和检测抗-东说念主 IgM的AlexaFlu〇r594抗-小鼠 IgG)的IFA娇傲通常的感染的红细胞亚群既勾搭IgM也结 合HB3var6抗体。
[0547] 图7.通过PfEMPl抗体爱护和调换并吞作用。在与单核细胞系Thp-Ι孵育之前， 用溴化乙锭染色并用PfEMPl抗体爱护感染的红细胞。通过流式细胞术检测并吞感染的红 细胞的Thp-Ι细胞。a)寄生虫株TM284b)寄生虫株HB3R+C)寄生虫株IT/R29d)寄生虫株 TM180。数据娇傲为以兔抗-东说念主红细胞抗体爱护的阳性对照的百分数。"非Ros类型A"阴 性对照由针对HB3var3 (不参与形成玫瑰花结的PfEMPl变体）的抗体组成。HB3R+寄生虫 培养物包括抒发HB3var3的感染的红细胞亚群（参见表S1)，其阐述了为安在此种情况下诱 导了并吞作用。"对照兔IgG"为由来自难免疫的兔的纯化的IgG组成的阴性对照。
[0548] 图8:来自ITvar60变体的DBL结构域。下划线的区域标明产生的重组卵白。缩 略形态如对于图la的。
[0549] 图9:通过抗-DBL抗体遏制形成玫瑰花结。玫瑰花结遏制测定以细则各样 ITvar60PfEMPl抗体对IT/PAR+寄生虫的剂量依赖性成果。将数据与无加入的抗体，在玫瑰 花结中包含至少40%的感染的红细胞的对照比较较。娇傲一式三份值的平均值和轨范偏 差。
[0550] 图10:通过ITvar60抗体的感染的红细胞的爱护和并吞作用。在与单核细胞系 Thp-Ι孵育之前，将感染的红细胞用溴化乙锭染色和用PfEMPl抗体爱护。通过流式细胞术 检测并吞感染的红细胞的Thp-Ι细胞。
[0551] 图11:针对勾搭IgM的形成玫瑰花结的寄生虫（株HB3R+第1列，株TM284第2 列，株9197IgM+第3列）测试的针对ITvar60的不同结构域的抗体。通过流式细胞术评 估名义反映性，其中每个点图的右上象限为检测的阳性的感染细胞。阳性对照是针对各个 寄生虫株的变体-特异的抗体（首行）。阴性对照是难免疫的兔IgG(底行）和针对来自 不勾搭IgM的变体（ITvar9)的结构域的抗体。抗-ITvar60的DBL4e识别全部三株，而 抗-ITvar60 的 DBL5 ε 和抗-ITvar60 的 DBL2 γ 仅识别株 TM284。
[0552] 图12:针对不勾搭IgM的形成玫瑰花结的寄生虫（株TM180第1列，株SA075第 2列，株IT/R29第3列，株Muzl2第4列）测试的针对ITvar60的不同结构域的抗体。通 过流式细胞术评估名义反映性，其中每个点图的右上象限为检测的阳性的感染细胞。阳性 对照是针对各个寄生虫株的变体-特异的抗体（首行）。阴性对照是难免疫的兔IgG(底 行）。针对ITvar60结构域的抗体不识别这些寄生虫株中的任一个。
[0553] 图13:通过与年事和住院时期匹配的对照（CM-对照）比较较的来自患有重症 (脑）疟疾（CM-病例）年青肯尼亚儿童的血浆样品识别活的IT/PAR+感染的红细胞（抒发 ITvar60抗原）的病例对照研究。数据来自流式细胞术;MFI:平均荧光强度。
[0554] 图14:通过与年事和住院时期匹配的对照（CM-对照）比较较的来自患有重症 (脑）疟疾（CM-病例）年青肯尼亚儿童的血浆样品识别活的IT/R29感染的红细胞的病例 对照研究。数据来自流式细胞术；MFI:平均荧光强度。
[0555] 图15:通过与年事和住院时期匹配的对照（CM-对照）比较较的来自患有重症 (脑）疟疾（CM-病例）年青肯尼亚儿童的血浆样品识别活的SA075R+感染的红细胞的病例 对照研究。数据来自流式细胞术;MFI:平均荧光强度。
[0556] 图16:A:来自对抒发HB3var6的寄生虫测试的重症疟疾病例的血浆；B:来自对表 达HB3var6的寄生虫测试的无并发症疟疾对照的血浆。
[0557] 图17:A:来自对抒发SA075varl的寄生虫测试的重症疟疾病例的血浆；B:来自对 抒发SA075varl的寄生虫测试的无并发症疟疾对照的血浆。
[0558] 图18:娇傲在用TM284varl免疫的小鼠中多克隆抗体应酬的ELISA。
[0559] 实践例1
[0560] 材料和方法。
[0561] 寄生虫和寄生虫培养物
[0562] 将恶性疟原虫实验室株（HB3， Muzl2， IT/R29， IT/PAR+， TM180和TM284)在补充的 RPMI中培养[59]并如形容的对于形成玫瑰花结进行遴荐[60]。成例查抄扫数培养物以 铲除支原体浑浊[61]。将寄生虫用针对MSPl，MSP-2和GLURP的引物基因分型[62]而且 与分享通常基因型但转录不同PfEMPl变体的IT/PAR+和IT/R29在遗传上永别开。使用 的其它寄生虫株是未遴荐的HB3和3D7(勾搭CD36)，IT/A4(勾搭CD36和ICAM-1)和对结 合东说念主脑内皮细胞进行遴荐的三株（HB3-HBEC，3D7-HBEC和IT-HBEC，Claessens等东说念主，在排 版中）。临床分离株来自喀麦隆（CAM1)，肯尼亚（KEN7，KEN14，KEN17，9197，SA075)，马里 (MAL27， MAL34， MAL43， MAL81， MAL103)和冈比亚（GAM627)。马里的分离株和 KEN7， KEN14 和KEN17为从之前的研究中冷藏保存的[30， 46]。在第一周期的体外滋长中，检测除 KEN7， KEN14和KEN17 (第三周期）和9197和SA075 (其已在3-4个月的体外滋长时期适于 培养、克隆和对形成玫瑰花结进行遴荐）之外的扫数临床分离株。如形容的，通过用抗-东说念主 IgM单克隆抗体（Serotec MCA1662)的免疫荧光测定（IFA)细则形成玫瑰花结的株的勾搭 IgM 的表型[38， 44]。
[0563] 说念德声明
[0564] 依照赫尔辛基宣言进行来自疟疾患者的临床分离株（血液样品）的收罗。知情 欢跃书获自患者的父母或监护东说念主而且经洛锡安地区伦理审查委员会（Lothian Regional Ethical Review Committee) (LREC//2002/4/34)，KEMRI 伦理审查委员会（KEMRI Ethical Review Committee)，网比亚政府/MRC实验室合股伦理委员会（Gambia Government/MRC Laboratories Joint Ethics Committee)，卩客麦隆寰球卫生部区域伦理委员会（Cameroon Ministry of Public Health regional Ethics committee)和巴马科大学的机构审查委员 会（University of Bamako Institutional Review Board)批准。由 BioGenes GmbH(柏 林，德国）证据对于保护用于科学主义的动物的1986年11月24日的欧盟准则（European Union guidelines)86/609/EWG和 1996年 3 月 18 日的欧洲协定（European Agreement)商 业上进行为物免疫。
[0565] Var基因抒发图谱和var基因测序。
[0566] 如之前形容的[24]和表S1中形容的进行RNA索要和var基因抒发分析。各个优 势的玫瑰花结-特异的var基因的全长序列源自来自以下的序列标签：a)从寄生虫基因组 数据库索要（在 http: //www. broadinstitute. org 的 HB3 和在 www. sanger. ac. uk 的 IT) b)使用针对上游和下贱PfEMPl区域的简并引物，对Muzl2varl的PCR-步移，克隆和测序 [63]。c)使用小载体文库对TM284varl和TM180varl的PCR-步移，克隆和测序[20]。
[0567] RNA 图章
[0568] 如形容的[44]，以地高辛符号的RNA探针进行寄生虫的同基因型的形成玫瑰花结 和不形成玫瑰花结对的RNA索要和RNA图章。翌日自各个寄生虫株的RNA与代表来自同源 玫瑰花结-特异var基因的一个DBL结构域的特异探针，以及用以检测扫数var基因的外 显子II探针杂交。
[0569] 重组卵白和多克隆抗体.
[0570] 如之前形容的坐蓐重组卵白[12]。对于各个玫瑰花结-特异的变体的 NTS-DBLla 重组卵白的结构域鸿沟如下：HB3var6Metl-Pro473 ;TM284varlMetl-Pro457 ; ITvar60Metl_Pro464 ;Muzl2varlMetl_Pro458 ;TM180varlMetl_Pro485。不形成玫瑰花结 的类型A PfEMPl变体HB3var3 (Metl-Pr〇468)用作对照。将各个卵白用于免疫两只兔，所述 兔一经被预筛选以幸免具有已有的针对东说念主红细胞或痕原虫的自然抗体的动物。由BioGenes GmBH(柏林，德国）进行免疫，血清收罗和总IgG纯化。
[0571] 免疫荧光测定（IFA).
[0572] 如形容的，用活的感染的红细胞以IFA测试免疫和免疫前血清[12， 44]。每一双免 疫的兔中，遴荐产生最亮的荧光信号并具有最低的布景的血清用于纯化总IgG。在扫数情 况下，两种兔血清都产生阳性PfEMPl-染色，仅在染色强度上具有较小互异。
[0573] 流式细胞术。
[0574] 如用于IFA的，进行用于流式细胞术的染色[12，44]，仅仅使用Hoescht(l. 25μ g/ ml)替代DAPI以染色感染的红细胞而且在第二次孵育洗涤后加入50 μ g/ml岩藻多糖以破 坏玫瑰花结。用0.5 %多聚甲醒固定细胞，加入50 μ g/ml岩藻多糖以拦截玫瑰花结再形 成，而且将每个样品500，000个事件（6￥611丨8)在136〇1:〇11-0;[01^1180111^1?11流式细胞仪上 分析。
[0575] 玫瑰花结遏制实验。
[0576] 将在环形期的恶性疟原虫培养物与不同稀释度的抗体和对照孵育过夜，而且如 形容的在次日通过显微镜评价玫瑰花结形成[12]。
[0577] 并吞作用测定。
[0578] 使用Thp-Ι细胞的并吞作用实验是如之前形容的[12]，仅仅使用岩藻多糖 OOOyg/ml)用于纯化寄生虫和松懈玫瑰花结。阳性对照是用兔抗-东说念主红细胞抗体 (ab34858， ABCAM， Cambridge， UK)爱护的寄生虫培养物。Muzl2varl抗体不包括在并吞作用 测定中，因为它们娇傲一些勾搭于未感染的红细胞的布景。
[0579] IgM ELISA。
[0580] 使用4°C过夜包被于ELISA平板的纯化的东说念主IgM(5 μ g/ml，Rockland)测试PfEMPl 抗体与东说念主IgM交叉反映的才气。在包含0.05%吐温20 (PBST)和5%牛奶的PBS中阻塞 1小时后，将孔与在包含1%牛奶的PBST(PBSTM)中的10，1和0. lyg/ml的兔抗-NTS DBL1抗体孵育。室温孵育1小时后，用PBST洗涤孔并与在PBSTM中的1:10， 000抗-兔 IgG-HRP (Sigma)再孵育一小时。如上述的洗涤之后，通过证据制造商的使用说明将孔与底 物3， 3'，5， 5'-四甲基联苯胺二盐酸（Sigma)孵育显色而且在450nm波长测量吸光度。作 为阳性对照，以 1:100(10 μ g/ml)，1:1000(1 μ g/ml)和 1:10000(0. 1 μ g/ml)使用兔抗-东说念主 IgM F(ab'）2-HRP(DAK0)。
[0581] 在穷乏IgM时PfEMPl抗体的名义交叉反映性。
[0582] 将汇聚的东说念主血清通过三个一语气轮次的在具有等量的抗-东说念主IgM(y_链特异 的）_琼脂糖（Sigma A9935)的旋转轮（15rpm)上室温孵育45分钟挥霍IgM。通过使用 抗-东说念主IgM单克隆抗体的卵白质萍踪说明给与的血清中IgM的穷乏。IT/PAR+寄生虫在 具有10%挥霍IgM的血清的补充RPMI中从环形期滋长过夜，而且将均分部分（阳性 对照培养物）与lmg/ml的东说念主IgM(Calbiochem)在37°C孵育1小时。随后洗漆IgM-阴 性和IgM-阳性培养物并通过如上文形容的流式细胞术测试交叉反映性PfEMPl抗体对 TM284varlNTS-DBLla 的名义反映性。
[0583] 对IgM-阳性的感染的红细胞的遴荐。
[0584] 如形容的使用包被有小鼠抗-东说念主IgM抗体（Serotec MCA1662)的M_450Epoxy Dynabeads(Dynal)对IgM-阳性的感染的红细胞遴荐寄生虫[64]。
[0585] 软件。
[0586] 使用Flowjo软件（Tree Star Inc.)分析流式细胞术数据，使用DNAstar Lasergene(DNAstar Inc.)进行DNA序列分析而且使用Prism(GraphPad软件）进行图像和 统计分析。
[0587] 颐养性 mAbs。
[0588] 一经坐蓐了对PfEMPl变体，TM284varl的表位具有特异性的单克隆抗体。这些抗 体将被用于研究成立颐养性单克隆抗体羼杂物以回转玫瑰花结形成的可能性。
[0589] 收尾
[0590] 矍铄由形成玫瑰花结的寄生虫转录的PfEMPl变体
[0591] 为了矍铄形成玫瑰花结的寄生虫的舛错名义抗原，体外培养源自不同国度的五 种恶性疟原虫实验室株（三种勾搭IgM，两种不勾搭IgM)，遴荐形成玫瑰花结的表型。对于 各个株，平行遴荐同基因型的玫瑰花结阳性（R+)和玫瑰花结阴性（R-)的群体[20]，而且 通过分析短PfEMPl序列标签查抄它们的var基因转录图谱[24]。各个株中的玫瑰花结-特 异的变体被矍铄为由形成玫瑰花结的群体（包括扫数检测的var基因序列中的三分之一到 二分之一）转录的上风var基因，其在不形成玫瑰花结的群体中穷乏/荒原（表S1中娇傲 实例）。各个上风玫瑰花结-特异的var基因的全长序列获安靖在方法中形容的序列标签。 形成玫瑰花结的变体大多数是类型A(图la)，其由保守的上游序列（UpsA)和与重症疟疾 关连的特有的N-结尾结构域类型（称为DBL α 1或"Cys2"）的存在截止[18， 24， 26]。来自 勾搭IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的变体形成赫然的分享荒原的PfEMPl结构的亚类，其 包含在PfEMPl (DBL ε和DBL ζ )中很少发生的结构域的三联体（triplet) [6]。对于非免疫 IgM的勾搭位点位于这些DBL ε / ζ结构域之间[43， 44] (AG和JAR，未发表的数据）。勾搭 IgM的结构域三联体通过至少一个其它结构域（DBLY)聚合于典型的类型A PfEMPl头部结 构[16， 18， 45](图la)。来自类型A PfEMPl变体的DBL α结构域落在基于序列同源性的 八个亚类（DBLa 1. 1至DBLa 1.8)中[6]。之前形容的形成玫瑰花结的变体（ITvar9，Palo Alto varO和PF13_0003)[11，20，21]都是DBLal.6亚类的。在此矍铄的玫瑰花结-特异 的变体是 DBL a 1. 5 (HB3var6 和 Muzl2varl)，DBL a 1. 8 (TM284 和 ITvar60)或 DBL a 2 (非类 型 A 的类型，TM180varl)之一 [6]。
[0592] 尽管有不雅察到的PfEMPl结构的相似性，但是在来自不同寄生虫株的，具有娇傲 介于 38.9% (ITvar60:TM180varl)和 62.6% (ITvar60:TM284varl)之间的成对的氨基酸 并吞性的介导玫瑰花结的结构域（NTS-DBLa ) [11，20， 21]的玫瑰花结-特异的变体间存在 相当多的序列各样性（表S2)。除了 TM284varl和ITvar60的第一 CIDR结构域（82. 2% ) 和HB3var6和Muzl2varl的第一 CIDR结构域（81. 1% ;参见对于扫数结构域类型的成对的 氨基酸并吞性的表S2-S7)外，来自形成玫瑰花结的变体的其它细胞外结构域不娇傲高水 平的氨基酸并吞性。
[0593] 通过RNA图章证实玫瑰花结-特异变体的正确矍铄（图lb ;之前对TM284娇傲的 [44])。对于各个寄生虫株，玫瑰花结-特异的PfEMPl探针在形成玫瑰花结的寄生虫（箭 头标出的）中检测到转录物，所述转录物在同基因型的不形成玫瑰花结的寄生虫中是穷乏 /弱的。使用矍铄扫数var基因的外显子II探针娇傲不形成玫瑰花结的寄生虫中其它转录 的var基因的存在（图lb)。
[0594] 为了引起针对形成玫瑰花结的PfEMPl变体的抗体，将各个玫瑰花结-特异变体 的N-结尾NTS-DBLa区域在大肠杆菌中抒发为重组卵白[12]，重组卵白在还原条目下迁 移率的转换娇傲在这些富半胱氨酸的卵白中存在二硫键（图lc)。遴荐NTS-DBLa是因为 在之前的研究中，它是勾搭红细胞以变成形成玫瑰花结的结构域[20， 21]，而且针对此区 域的变体-特异的抗体在遏制形成玫瑰花结方面最灵验[12， 21]。
[0595] PfEMPl抗体针对实验室-妥当的恶性疟原虫株的功能活性和交叉反映性
[0596] 使用重组卵白免疫兔[12]，以调换抗体以细则来自不同恶性疟原虫株的玫瑰花 结-特异的PfEMPl变体是否分享共有表位。免疫荧光测定（IFA)娇傲，针对五种变体中 的每个的抗血清产生点状的荧光，其表征具有同源寄生虫株的活的感染的红细胞名义上的 PfEMPl抗体（图2a中娇傲带有ITvar60抗体的IT/PAR+寄生虫）。通过IFA，兔免疫前血 清和难免疫的兔对照血清是阴性。来自各个抗血清的纯化的总IgG的滴定度娇傲一直到低 浓度针对同源寄生虫的特异名义反映性（滴定至极为0. 02-1. 56 μ g/ml的总IgG，图2b和 图2c，加粗的矩形）。
[0597] 进犯的是，PfEMPl抗体也娇傲与异源的形成玫瑰花结的株的名义反映性。这在 勾搭IgM的形成玫瑰花结的株（HB3R+，TM284和IT/PAR+)和它们的抗体（分别针对变 体HB3var6，TM284varl和ITvar60)之间是尤其显耀的，对于异源的抗体：寄生虫组合 具有〈10 μ g/ml的名义反映性（图2c)。不勾搭IgM的形成玫瑰花结的株（Muzl2， TM180 和IT/R29)也被针对勾搭IgM的形成玫瑰花结的变体的抗体识别，尽管需要更高的浓度 (100-400 μ g/ml的总IgG，图2c)。尽管这些浓度高，但它们仍然施展相当大的全血清的稀 释度（相当于1/100至1/25的稀释度），因此，它们在体内是可能达到的。
[0598] 针对形成玫瑰花结的PfEMPl变体的抗体不识别对其它粘附表型进行遴荐的寄生 虫（图2c)，所述表型包括勾搭⑶36或ICAM-1 (抒发类型B和C var基因的寄生虫）或结 合脑内皮细胞（抒发类型A和B/A var基因的替代亚群的寄生虫）。因此，仅具有分享的 粘附表型的寄生虫分享由针对PfEMPl的交叉反映性抗体识别的表位。
[0599] 通过抗体体内名义识别活的感染的红细胞很有可能导致通过效应子机理比如吞 噬作用或补体介导的细胞溶化的寄生虫取销[13]。玫瑰花结-遏制也不错是防备病理的 微血管阻拦而在体内所需的。咱们因此查抄图2中娇傲的由PfEMPl抗体导致的交叉反映 性名义识别，是否升沉为效应子功能中的交叉反映性。除了尽管有细腻的名义反映性（图 2c)，但不被遏制的TM180(图3a，褐色弧线）之外，PfEMPl抗体娇傲针对同源寄生虫株的 灵验的玫瑰花结-遏制（图3a，红色弧线），对形成玫瑰花结的50%遏制浓度（IC50)为介 于0. 8-8 μ g/ml之间。寄生虫株TM284， IT/PAR+和TM180都娇傲通过异源抗体的玫瑰花结 遏制（图3a，蓝色弧线）。在更高的浓度（lmg/ml的总IgG)，玫瑰花结遏制中的交叉反映 性以致更显耀，其中由针对勾搭IgM的形成玫瑰花结的PfEMPl变体中的至少一个的抗体 遏制扫数株（图3b)。
[0600] 还娇傲针对来自勾搭IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的PfEMPl变体的抗体通过诱 导同源和异源的感染的红细胞的并吞作用而具有交叉反映性爱护成果（图3c和图7a和 b)。比较之下，针对来自不勾搭IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的PfEMPl变体的抗体，仅有 效爱护同源寄生虫（图7c和d)。
[0601] 针对恶性疟原虫临床分离株的抗-PfEMPl抗体的功能活性和交叉反映性
[0602] 一经娇傲在恶性疟原虫实验室株中交叉反映性PfEMPl抗体的名义识别和生物效 应子功能，咱们使用来自喀麦隆，肯尼亚，马里和网比亚的崭新临床分离株探究交叉反映 性的地舆范围。临床分离株中形成玫瑰花结的感染的红细胞的比例在分离株之间有变化 (15-40%)，莫得如资历对形成玫瑰花结进行重复遴荐的实验室株那么高。遴荐临床分离 株是因为它们在玫瑰花结中包含至少15%的感染的红细胞，而且娇傲扫数的测试分离株。 解冻十株崭新的临床分离株，而且发现除一个之外的全部都为勾搭IgM的形成玫瑰花结的 表型（通过用IFA检测感染的红细胞名义的IgM测试）。这与之前的娇傲来自肯尼亚儿童 的临床分离株中玫瑰花结频率和IgM勾搭的强的正关连的数据一致[38]。
[0603] 通过用IFA的活的感染的红细胞的点状荧光（类似于图2a)和通过流式细胞术 (图4a)检测所述组的PfEMPl抗体的名义反映性。弓丨东说念主扎眼的是，针对两种PfEMPl变体 (HB3var6和TM284varl)的抗体足以提供针对扫数地舆位置上各样的勾搭IgM的形成玫瑰 花结的分离株的名义反映性（图4b和c)。在各个分离株中抗-PfEMPl阳性和IgM阳性细 胞的比例细腻无比相称（皮尔森关连性（Pearson Correlation) r = 0· 934， P = 0· 006 ;图4c， 将IgM阳性细胞与阳性PfEMPl抗体染色的细胞比较较）。在四株分离株中也不雅察到玫瑰 花结遏制，当使用抗 -PfEMPl抗体的组合（pool)时，加多到六株分离株（图4b)。不勾搭 IgM的临床分离株（MAL103)和两株最近妥当培养的遴荐玫瑰花结的不勾搭IgM的肯尼亚 株（9197和SA075)不被PfEMPl抗体识别（图4b)。因此，在临床分离株中，仅在娇傲勾搭 IgM的形成玫瑰花结的表型的寄生虫中看到PfEMPl抗体的交叉反映性。
[0604] 咱们计划了上述收尾不错由PfEMPl抗体与东说念主IgM (其勾搭来自培养基的感染的红 细胞名义）交叉反映而不是由于PfEMPl自身内分享的表位阐述的可能性。然则，在ELISA 中，所述PfEMPl抗体不识别东说念主IgM(图5a)，而且当寄生虫在IgM穷乏的情况下生永劫，异 源寄生虫株的名义反映性得以看护（例如，如在图5b中娇傲的，在IgM穷乏的情况下，IT/ PAR+寄生虫娇傲与TM284varl抗体的名义反映性）。
[0605] 进一步通过领受最近妥当培养的娇傲不勾搭IgM的形成玫瑰花结的肯尼亚株 9197和SA075 (图4b)，使用包被有抗-东说念主IgM抗体的磁珠遴荐它们对IgM的勾搭，娇傲在 不同寄生虫分离株中，存在勾搭IgM的形成玫瑰花结的变体。三轮遴荐后，得回勾搭IgM 的形成玫瑰花结的寄生虫群体，其被针对HB3var6的抗体（9197IgM-遴荐的，图6)或针 对TM284varl的抗体（SA075IgM-遴荐的，数据未娇傲）识别。双染娇傲感染的红细胞的 通常的亚群既勾搭IgM也勾搭HB3var6抗体（图6b)。
[0606] 辩论
[0607] 在此职责中，研究了由代表两种主要的形成玫瑰花结表型的恶性疟原虫株抒发的 PfEMPl变体。发现勾搭IgM的形成玫瑰花结的寄生虫抒发独到亚类的类型A PfEMPl变体， 所述变体的特征为DBL α 1. 5或DBL α 1. 8N-结尾结构域和紧邻跨膜区的DBL ε /DBL ζ结构 域的三联体。当针对同源寄生虫测试时，针对勾搭IgM的形成玫瑰花结的变体的Ν-结尾 区域产生的抗体是玫瑰花结形成的灵验遏制剂（对于玫瑰花结的遏制IC50 < 1 μ g/ml的 总IgG，图3a)，证实这些变体在玫瑰花结形成中的作用。此外，针对勾搭IgM的形成玫瑰 花结的变体的抗体是交叉反映性的，娇傲全宇宙范围内分享通常粘附表型的不同寄生虫 分离株的活的感染的红细胞的名义识别和玫瑰花结遏制。比较之下，如之前形容的，针对 来自不勾搭IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的类型A PfEMPl变体产生的抗体是变体特异的 [11，20， 21]。这些数据标明不是扫数类型A PfEMPl变体调换交叉反映性抗体，而且类型 A变体的某些亚类不错黑白常有交叉反映性的。据咱们所知，这是第一次报说念形容奏效诱 导针对严重儿童期疟疾中触及的PfEMPl变体的鄙俚交叉反映性名义识别抗体。一经形容 针对孕期疟疾中触及的var2CSA的鄙俚交叉反映性抗体[47， 48]，然则，var2CSA是比在非 跳动菌株的类型A PfEMPl变体中看到的具有更多戒指的序列各样性的跳动株的var基因 的独到例子[49]。
[0608] 这里详实表征了三种来自勾搭IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的PfEMPl变体：来 自株HB3的HB3var6，来自株TM284的TM284varl和来自株IT/PAR+的ITvar60。之前，已 经在两种其它源自IT/FCR3的寄生虫系中将ITvar60与形成玫瑰花结规划起来[50， 51]， 而且这里被证实为勾搭IgM的形成玫瑰花结的变体。如对PfEMPl预期的，尽管在PfEMPl 结构方面有它们的相似性（图1)，但是三种不同的勾搭IgM的形成玫瑰花结的变体娇傲 氨基酸序列方面相当大的各样性（表S2-S7)。在近期测序的恶性疟原虫株IGH的基因组 (IGHvarl2， IGHvar22和IGHvar24[6])中不错看到具有通常的"形成玫瑰花结的IgM"类型 的结构域结构的其它变体。此外，ITvar60样变体存在于测序的来自巴布亚新几内亚的恶 件拒原虫株D10( broadinstitute. org)中。总合在一皆，这些数据指示具有 形成玫瑰花结的IgM类型的PfEMPl结构的变体广泛存在于地舆位置上不同的恶性疟原虫 分离株中。咫尺的研究的一个局限是莫得富饶的来自临床分离株的材料用以矍铄和测序由 形成玫瑰花结的寄生虫转录的PfEMPl变体，以允许与实验室株比较。来自两个妥当培养的 临床分离株的勾搭IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的遴荐（图6)将允许咱们进一步详实研 究它们的var基因。玫瑰花结-特异的变体的正确矍铄（表S1)和全长var基因的测序对 于不具有可用的全基因组序列的分离株仍然是繁重和耗时的进程。然则，来自形成玫瑰花 结的临床分离株的PfEMPl结构和序列更鄙俚的研究对于这里纪录的抗体交叉反映性奈何 触及序列各样性和PfEMPl类型的全面和洽将是舛错的。
[0609] 不勾搭IgM的形成玫瑰花结的寄生虫的之前的研究矍铄寄生虫形成玫瑰花结的 配体为PfEMPl变体（ITvar9， Palo Alto varO和PF13_0003)，其娇傲DBLa结构域的八种 可能的亚类中的一个，DBL a 1.6 [11，20， 21]。比较之下，这里形容的类型A形成玫瑰花结 的变体具有 DBL a 1. 5 (HB3var6 和 Muzl2varl)或 DBL a 1. 8 (ITvar60 和 TM284varl)之一。 临床分离株娇傲与HB3var6抗体（DBL α 1. 5类型）或TM284varl抗体（DBL α 1. 8)之一的表 面反映性，但很少与两种抗体都有交叉反映性（图4b)。这些数据指示这两种主要DBL α 1 类型不错组成不同地域分离株中勾搭IgM的形成玫瑰花结的表型的基础，尽管赫然需要 进一步序列信息以证实该思法。TMISOvarl不同于其它玫瑰花结-关连变体，因为其具有 UpsB序列和DBLa 2亚型，而且这不错代表形成玫瑰花结的表型的不同类型，其需要进一 步研究。综合本研究的研究收尾和之前发表的职责，咱们揣测，具有DBL a 1. 5， DBL a 1. 6或 DBL a 1. 8结构域的扫数类型A PfEMPl变体不错是玫瑰花结-介导的变体。如果是正确的， 这将标明来自每个恶性疟原虫分离株的类型A var基因组库的很大比例（大致三分之一到 二分之一）不错编码形成玫瑰花结的变体[6]。这将默示由寄生虫在粘附表型中的多数投 入，其对寄生虫妥当度的益处尚且未知。
[0610] Rask等东说念主[6]近来提供通过注视"结构域盒"（平日一皆存在的PfEMPl结构域组 合）评估PfEMPl类型的替代的面孔。他们矍铄了在类型A var基因中常见的七个结构域 盒[6]。咱们的数据指示，这些结构域盒中的两个与形成玫瑰花结的表型关连联：结构域盒 16，特征为如在耶3 ￥&冰中看到的聚合于(：101^6的〇81^1.5/6，和结构域盒11，特征为 如在ITvar60和TM284varl看到的聚合于CIDRP2和DBLY7的DBLa 1.8。尽管需要更多 的职责以概述这些收尾并细则特定DBLa亚类和结构域盒是否老是与形成玫瑰花结关连 联，但是咱们的数据代表在将PfEMPl序列与寄生虫粘附表型关连联方面的进犯方法。
[0611] 咫尺的数据的一个无法阐述的特征是，尽管两组变体中有赫然相当的氨基酸各样 性，但是为何勾搭IgM的形成玫瑰花结的变体在由指令分享的表位的PfEMPl抗体识别方面 娇傲交叉反映性，然则不勾搭IgM的变体不娇傲。咱们计划了 IgM自己不错是交叉反映性 的原因的可能性，然则咱们展示在ELISA中PfEMPl抗体不识别东说念主IgM，而且当寄生虫在缺 乏东说念主IgM的情况下生永劫，PfEMPl抗体仍然识别异源株（图5)。其可能是，小的序列基序 (比如由Rask等东说念主[6]形容的仅存在于勾搭IgM的变体中的同源性区块中的一种）阐述了 交叉反映性。将需要勾搭IgM的形成玫瑰花结的变体的另外的实例以研究此种可能性。备 选地，可能IgM对PfEMPl的勾搭影响其三级或四级结构，使其更易接近针对分子的N-末 端的抗体。然则，最近的数据指示，IgM勾搭使得PfEMPl较不易接近特异抗体[41]。
[0612] 之前对于PfEMPl的职责指示，抗体应酬主如若变体特异的[10， 11，12]，结构域之 间有一丝交叉反映性[52]。然则，其它报说念指示，交叉反映性抗体不错存在[53， 54， 55]并 且不错在抗原变异进程中的组织PfEMPl抒发中施展作用[56]。对临床疟疾的免疫性的逐 步得回是否与针对许多不同变体类型的抗体的鄙俚的组库的得回关连，或是否由于交叉 反映性应酬的产生仍未惩处。尤其在恫吓人命的疟疾的情况下，针对PfEMPl的抗体的作 用不明晰。已知儿童在小数感染后变得对重症疟疾免疫[13， 57]，而且重症疟疾与得回针 对广泛识别的变体的抗体关连[14， 15， 58]。咫尺的思法指示重症疟疾由抒发变体名义抗原 的抗原戒指的亚类[2](可能由类型A var基因编码[26， 27])的寄生虫引起。将预期此种 寄生虫的"抗原戒指的"亚类具有娇傲保守的序列和/或保守的表位的变体名义抗原（可 能是PfEMPl)，所述保守的序列和/或保守的表位将被娇傲与不同寄生虫株的名义反映性 的抗体识别。这里报说念的具有分享的组成毒力关连表型基础的表位的变体的亚类的研究结 果不错代表寄生虫的此种"抗原戒指的"亚类的第一种实例。
[0613] 总的来说，这些数据娇傲，针对来自勾搭IgM的形成玫瑰花结的实验室株的类型 A PfEMPl变体亚类产生的抗体对分享通常的粘附表型的全球的寄生虫分离株有鄙俚的交 叉反映性。具有分享的毒力关连表型的恶性疟原虫分离株中分享的表位的这种发现不错构 成儿童在小数感染后得回对恫吓人命的疟疾的免疫性的流行病学不雅察的基础[13， 57]。最 进犯的是，通过用组成毒力表型基础的舛错PfEMPl变体免疫调换鄙俚的交叉反映性抗体 的才气，指示贪图侵扰设施以谢绝重症疟疾是本质的主义。
[0614] 实践例2
[0615] 实践例1中提供的数据荟萃于针对来自勾搭IgM的形成玫瑰花结的PfEMPl变体 的N-结尾区域（NTS-DBLla)的抗体。实践例2中提供的实验，研究针对其它来自这些 PfEMPl变体的DBL结构域的抗体是否也将娇傲交叉反映性。这将弗成从结构域之间的氨基 酸相似性（其是低的，大部分介于20-40%的氨基酸并吞性之间）的研究中预计。
[0616] 材料和方法
[0617] 如在主要的手稿中形容的，在大肠杆菌中制备重组卵白而且在兔中产生抗体。通 过如在实践例1中形容的流式细胞术，玫瑰花结遏制和并吞作用调换评估名义反映性。
[0618] 收尾：
[0619] 针对来自ITvar60变体的扫数DBL结构域（图1A和图8以红色娇傲的下部区域） 而且也对来自HB3var6变体的DBL4e和DBL5e (FiglA)产生抗体。
[0620] 测试针对同源寄生虫株（IT/PAR+)的ITvar60抗体
[0621] 测试ITvar60抗体针对同源寄生虫株（IT/PAR+)的活的感染的红细胞的名义反映 性。除了针对DBL3(的抗体（其仅在100 μ g/ml产生名义反映性）除外，扫数抗体娇傲 点状荧光（PfEMPl的特征），低至低浓度（参见表1)。针对ITvar60的其它结构域的抗体 遏制形成玫瑰花结，尽管莫得一个如NTS-DBL1 α抗体那样灵验（参见图10和表1)。还测 试了 ITvar60抗体调换感染的红细胞的并吞作用的才气（在体内可能进犯的功能）。针对 ITvar60的DBL2 γ的抗体大概爱护感染的红细胞并类似于NTS-DBLla抗体调换并吞作用 (参见图11下图）。酷爱酷爱的是，尽管有细腻的名义反映性和玫瑰花结遏制才气，但是针对 ITvar60的DBL4 ε和DBL5 ε的抗体不大概爱护和调换并吞作用。
[0622] 表1在针对IT/PAR+寄生虫的不同测定中ITvar60Abs的灵验性。
[0623]
【权益要求】
1. 恶性痕原虫（Plasmodium falciparum)红细胞膜卵白-1 (PfEMPl)抗原或其一个或 多个片断，其用于产生免疫应酬的用途。
2. 如权益要求1所述的用于权益要求1所述用途的PfEMPl抗原，其中所述PfEMPl抗 原是源自IgM形成玫瑰花结的恶性疟原虫变体。
3. 如权益要求1或2所述的用于权益要求1或2所述用途的PfEMPl抗原，其中所述 PfEMPl抗原选开脱以下组成的组： (i) HB3var6 ； (ii) TM284varl ;和 (iii) ITvar60〇
4. 如权益要求3所述的用于权益要求3所述用途的PfEMPl抗原，其中所述PfEMPl抗 原HB3var6获自恶性疟原虫株HB3 ;所述PfEMPl抗原TM284varl获自恶性疟原虫株TM284 而且所述PfEMPl抗原ITvar60获自恶性疟原虫株IT/PAR+。
5. 如任一项在前权益要求所述的用于任一项在前权益要求所述用途的PfEMPl抗原， 其中所述PfEMPl抗原由以下编码： (i) 以SEQ ID N0S1，2， 3， 4， 5或6或其片断给出的序列中的一种或多种； (ii) 相对由SEQ ID N0S: 1，2， 3， 4， 5或6或其片断提供的序列中的一种或多种娇傲至 少80 %同源性或并吞性的序列。
6. 如任一项在前权益要求所述的用于任一项在前权益要求所述用途的PfEMPl抗原， 其中所述PfEMPl抗原包含PfEMPIDuffy勾搭样（Duffy Binding Like) (DBL)结构域。
7. 如权益要求6所述的用于权益要求6所述用途的PfEMPl抗原，其中所述DBL结构 域是选开脱以下组成的组的一种或多种： (i) HB3var6， TM284varl 和 / 或 ITvar60NTS-DBLl α 结构域； (ii) ITvar60DBL4 ε 结构域；和 (iii) ⑴和/或（ii)的（免疫原性/抗原性）片断。
8. 如任一项在前权益要求所述的用于任一项在前权益要求所述用途的PfEMPl抗原， 其中所述免疫应酬 (i) 灵验针对疟原虫、恶性疟原虫的不同株和分离株； (ii) 包含下述抗体，所述抗体对所述HB3var6、TM284varl和/或ITvar60PfEMPl抗 原娇傲一定进度的亲和力、遴荐性和/或特异性和对除了所述HB3var6、TM284varl和/或 ITvar60PfEMPl抗原之外的PfEMPl抗原娇傲一定进度的亲和力、遴荐性和/或特异性。
9. 一种疫苗或疫苗组合物，其包含一种或多种选开脱以下组成的组的PfEMPl抗原： (i) PfEMPl抗原或其一个或多个片断； (ii) 勾搭IgM的形成玫瑰花结的PfEMPl ; (iii) PfEMPl 变体 HB3var6 ; (iv) PfEMPl 变体 TM284varl ; (v) PfEMPl 变体 ITvar60 ; (vi) PfEMPlDBL 结构域； (vii) NTS-DBLla 结构域； (viii) DBL4 ε 结构域； (ix) PfEMPl 变体 HB3var6 的 NTS-DBL1 α 结构域； (x) PfEMPl 变体 TM284varl 的 NTS-DBL1 α 结构域； (xi) PfEMPl 变体 ITvar60 的 DBL4 ε 结构域；和 (x)(i)-(ix)中任一个的（免疫原性/抗原性）片断。
10. 如权益要求9所述的疫苗或疫苗组合物，其用于产生免疫应酬的用途。
11. 如权益要求10所述的用于权益要求10所述用途的疫苗或疫苗组合物，其中在东说念主 或青少年东说念主中产生所述免疫应酬。
12. 如权益要求9所述的疫苗或疫苗组合物，其用于颐养或谢绝疟疾或重症疟疾。
13. 对选开脱以下组成的组的PfEMPl中的一种或多种娇傲一定进度的亲和力、特异性 和/或遴荐性的抗体： (i) PfEMPl抗原或其一个或多个片断； (ii) 勾搭IgM的形成玫瑰花结的PfEMPl ; (iii) PfEMPl 变体 HB3var6 ; (iv) PfEMPl 变体 TM284varl ; (v) POEMPl 变体 ITvar6〇 ; (vi) PfEMPlDBL 结构域； (vii) NTS-DBLla 结构域； (viii) DBL4 ε 结构域； (ix) PfEMPl 变体 HB3var6 的 NTS-DBL1 α 结构域； (x) PfEMPl 变体 TM284varl 的 NTS-DBL1 α 结构域； (xi) PfEMPl 变体 ITvar60 的 DBL4 ε 结构域；和 (x)(i)-(ix)中任一个的（免疫原性/抗原性）片断。
14. 如权益要求13所述的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
15. 如权益要求13或14所述的抗体，其用于 (i) 颐养或谢绝痕疾和/或重症痕疾；和/或 (ii) 谢绝疟疾中的红细胞玫瑰花结形成。
16. -种会诊疟疾或重症疟疾的方法，所述方法包括以下方法： (a) 提供来自要被测试的受试者的样品；和 (b) 将（a)中提供的样品与证据权益要求13或14所述的抗体在足以允许所述抗体和 存在于所述样品中的任何PfEMPl抗原之间的勾搭的条目下搏斗； (c) 任选地移除未勾搭的抗体；和 (d) 检测抗体/PfEMPl抗原复合物的存在； 其中检测出抗体/PfEMPl抗原复合物指令受试者患有疟疾和/或重症疟疾，或处于发 展为痕疾和/或重症痕疾的风险中。
17. 如权益要求16所述的方法，其中所述受试者是东说念主受试者或青少年东说念主受试者。
【文档编号】A61K39/015GK104093417SQ201280067766
【公开日】2014年10月8日 苦求日历:2012年11月22日 优先权日:2011年11月22日
【发明者】简·亚历山德拉·罗， 阿什法克·古姆拉 苦求东说念主:爱丁堡大学董事会
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